【实验技术】菌液的纯化—平板划线法

在收到质粒和甘油菌后，如需使用菌液提取更多的质粒，有两种方法可以纯化菌液：平板划线法与平板涂布法。由于在运输过程中菌液的活性或多或少会受到影响，我们更建议使用平板划线法来挑取单菌落，下面我们一起来了解一下平板划线法。

接种环沾取少量菌液作为待分离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来,如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。常使用三区划线法。

用途：一般多用于菌株的纯化

优点：简便快速，可以观察菌落特征

缺点：不能用于计数

实验材料：

菌种、普通琼脂平板、肉汤培养基、半固体培养基、斜面培养基、接种环、接种针、酒精灯。

操作方法(三区划线法）：

（全程需在超净工作台内操作）

1.右手拿接种环，烧灼冷却后，取菌液一环。

2.左手抓握琼脂平板（让皿盖留于桌上），在酒精灯火焰左前上方，使平板面向火焰，以免空中杂菌落入，右手将已沾菌的接种环在琼脂表面密集而不重叠的来回划线，面积约占整个平板的1/5-1/6，此为第一区。划线时接种环与琼脂呈30-40度角轻轻接触，利用腕力滑动，切忌划破琼脂。  

3.接种环上多余的细菌可烧灼（每划完一个区域是否需要烧灼灭菌视标本中含菌量多少而定），待冷后，在划线末端重复2-3根线后，再划下一区域（约占1/4面积），此为第二区。

4.第二区划完后可不烧灼接种环，用同样方法划第三区，划满整个平皿。

5.划线完毕，将平板扣入皿盖并作好标记，置37℃温箱孵育12-18小时观察琼脂表面菌落分布情况，注意是否分离出单个菌落。

平板划线法单克隆菌落效果：

为什么划不出单菌落？常见原因如下：

1.没有充分利于好划线区域；

2.各区域线过于密集，线与线之间重叠；

3.与前一区交叉过多；

4.划线时接种环接触点变动，未始终保持接种环的一点接触琼脂表面；

5.未掌握好划线力度与角度，划破琼脂；

6.待接种的细菌菌量过多时，可在第一区划线完成后进行灼烧，再进行第二、三区的划线。