拜耳、勃林格殷格翰、BMS和杨森:早期制剂开发决策
在创新药实际的发现过程中，动物制剂的开发是相当重要的，而是通常会使用到增溶的制剂策略。有的时候，动物制剂的开发时间较短，表征较少，更甚者此时的制剂开发并非制剂人员来主导。那么动物实验的结果本身将很难解释，并为后面的制剂开发提供怎样的启示呢?不得而知。查看国际巨头开发相关文献，看到巨头们的经验，会存在开发评估小组，而且深刻意识到制剂人员在药物早期发现中的重要作用。当然，国内还有很长的路要走！！！只是可能花费点代价和金钱。
早期药物开发中制剂开发的体内模型和决策树：生物药剂学开发的当前实践和建议综述
In vivo models and decision trees for formulation development in early drug development: A review of current practices and recommendations for biopharmaceutical development
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摘要：使用体内动物模型预测新化学实体性能的能力已经研究了20多年。制药公司使用自己的战略，从早期开发开始就决定最合适的配方。在本文中，7家公司讨论了欧洲制药行业协会联合会(EFPIA)四个合作伙伴（拜耳、勃林格殷格翰、Bristol Meyers Squibb和杨森）的生物药剂学决策树，其中4家公司目前没有定义决策树。讨论了每个决策树的优势、劣势和改进机会。药物发现与开发界面（ drug discovery & development interface）负责先导优化和候选药物选择的药物动力学学家和配方前科学家都对配方决策的总体进展做出了贡献。为IMI资助的OrBiTo项目设计的数据库中包含化合物信息的小数据集，用于检查测量的物理化学、溶出度和相对生物利用度参数之间的相互关系。
在首次人体试验（FIH）研究中，在选择新的化学实体（NCE）时，仅从体外和/或计算机工具无法很好地预测药物及其制剂的体内行为。需要尽早确定风险、挑战和策略，以准备在动物毒理学研究和FIH临床试验中提供足够临床前暴露的制剂，这是IMI资助的OrBiTo项目的重要组成部分。本文对体内模型和生物药剂学决策树在新型口服药物开发中的应用提供了一个视角。
1.引言
预测体内剂型性能的能力已经研究了20多年[1]。尽管如此，在药物发现界面负责先导优化和候选药物选择的制剂前科学家面临着艰巨的任务。在选择新的化学实体（NCE）时，需要有关药物在生物相关条件下从制剂中溶出的信息，但目前仅从体外和/或计算机工具中无法很好地获得这些信息。在动物毒理学研究和患者临床试验中提供足够临床前暴露的制剂的制备需要对相关风险、挑战和开发策略进行早期评估。所采用的方法可能不同[2–5，29]，但通常包括考虑关键因素组合的逐步方法，如与API在生物相关介质中的溶解度相关的口服剂量，即生物相关剂量数（DN）。此外，关于API特征的体内、体外和计算机信息对于补充单参数概念是必要的，例如溶解所用剂量的体积（VDAD），这与DN概念密切相关。
在一项针对参与由IMI倡议资助的公私合作OrBiTo的欧洲制药工业协会（EFPIA）合作伙伴进行的未发表的调查中，评估了目前在口服制剂开发过程中何时、如何以及使用哪些体内工具。事实证明，所有12名应答者都应用动物模型进行配方开发，尤其是在药物发现或早期开发阶段。狗和老鼠是迄今为止最受欢迎的物种。除了动物研究，超过一半的应答者表示经常或总是在配方开发中应用人类研究。总的来说，调查清楚地表明，公司的配方开发严重依赖动物模型，也依赖人类模型。
根据调查，OrBiTo启动前的几篇出版物表明，大鼠、狗和非人灵长类动物是API药物和模拟开发最常用的体内模型。因此，在本手稿中，研究了当前与动物使用有关的决策树，记住3Rs（替换、减少和细化）是研究中使用动物的所有决策中的一个有趣的影响因素。此外，还提供了一些关于研究设计、技术、体内和体外参数的指导，这些参数在确定决策的适当截止点以及早期开发中的计算机建模如何帮助决策方面发挥着重要作用。存在先前提出的决策树[6-8]。乌普萨拉EUFEPS第五届药物吸收、运输和递送世界大会[9]指出，许多主要分别基于溶液和悬浮制剂的绝对和相对生物利用度数据，并已实施，例如杨森制药公司和拜耳公司。
本手稿中作为OrBiTo项目的共识提出的决策树（DT）也与OrBiTo内其他工作包开发的API和配方产品的体外分析新方法（WP1-药物的体外表征，WP2-配方产品的体内表征方法和WP4-计算机模型）有关。内容来源于人类胃肠生理学的新信息，并与最常见的动物进行了比较。
在最近的一篇综述文章中，有人指出，犬胃肠道（GIT）的特征，特别是大型犬（体重约30公斤）的最终特征，与人类有各种相似之处。得出的结论是，与人类胃肠道最重要的区别与BCSII类药物的胆汁浓度更高、溶解度/溶出更高、BCSIII类药物的吸收率更高以及结肠特征的差异有关[12]。
在将狗与大鼠作为筛选工具的比较中，最近对包含大鼠和狗的数据的化合物数据库的回顾性分析表明，在狗身上，FaSSIF中极难溶解的化合物（<0.01mg/mL）主要对应于混悬液与溶液（Frel，混悬液/溶液）的相对生物利用度小于20%。对于大多数FeSSIF溶解度高于0.1mg/mL的API，给药混悬液后在狗体内的暴露与给药API溶液后的暴露相当（Frel，混悬液/溶液接近1）。与狗不同的是，大鼠的趋势不太清楚：对于可溶性极低的原料药，在大鼠身上观察到更高的相对生物利用度，甚至完全口服吸收，这表明在低可溶性化合物的情况下，狗实际上可能比大鼠更有辨别力。作为对大鼠和狗观察结果的解释，数据库评估中渗透率的差异似乎不那么重要[14]。
在大鼠和狗的数据都可用的大多数原料药中，大鼠的Frel,susu/sol高于狗的Frel,susu/sol。无论是餐前状态，还是胃或十二指肠中的电离百分比，似乎都不能解释大鼠和狗之间的差异[14]。
迄今为止，文献中尚未讨论的其他问题包括作为制剂成分的关键辅料的影响以及临床前物种反映其对吸收影响的能力。例如，当寻找口服溶液或静脉给药的制剂时，通常需要使用增溶剂。例如，口服PEG400往往会增加体内肠道的水量，并可能影响肠道的通透性。对于静脉给药，已知含有Tween80（或Solutol）的剂型会导致狗体内组胺释放，而在大鼠体内没有观察到这种作用。DMSO是另一种常用的增溶剂，用于两种给药途径，即使体积百分比较低，它也会在两种物质中产生不希望的渗透作用。在体外观察到PEG400对外排转运蛋白的抑制作用；目前尚未在体内得到证实[12，13]。
进一步的研究领域涉及作为体内吸收/生物利用度模型的特定动物的菌株和预处理条件。一般来说，比格犬最常用于早期配方开发[19,20]。
配方研究显示，在使用和不使用pH降低剂预处理狗的情况下（例如，肌肉注射1NHCl或0.6mg/kg五肽胃泌素，以更好地预测人类生理[18]）。文章将讨论物种选择和生理变量方面的问题。
本文将探讨7家顶级制药公司中3家的动物研究时间和研究设计。基于这些科学界的最佳实践和他们自己公司的经验，将提出一个共识驱动的决策树或战略。第一项将审查选择NCE或活性药物（API）所需的决策和数据，这些药物的性质允许未来的开发活动在临床前开发早期以最佳配方向前推进[25]。
本文将总结几家主要制药公司目前使用的一些实践，并提出一些在早期制剂开发过程中进行体内研究的最佳实践的通用规则或标准。
2.参与EFPIA公司早期配方选择的当前决策树
2.1.拜耳
2.1.1拜耳当前决策树
拜耳临床1期研究候选药物制剂开发类型的决策基于（i）在人体内溶解所施加剂量（VDAD）所需的体积，以及（ii）在大鼠体内以混悬液与溶液的形式口服给药的微粉化晶体化合物材料的相对口服生物利用度（Frel，susp/sol）[37]。该程序最近发表[4，14]。
VDAD的计算基于结晶的、无溶剂的、微粉化的API在pH1（0.1MHCl）和pH7（磷酸盐缓冲液）的水溶液中测得的热力学溶解度和预测的人类治疗剂量。
如果中性化合物VDAD小于3L，，如果酸性化合物VDAD在pH7时小于6mL，则为，如果碱性化合物VDAD在pH1时小于175mL，则建议化合物开发常规立即释放（IR）片剂。对于所有其他化合物，应进行大鼠Frel、混悬液/溶液研究，并用于以下决策：简言之，将受试化合物以两种不同的制剂，以mg/kg为基础，以估计的人类治疗剂量口服给导尿管雄性Wistar大鼠：（i）例如乙醇/PEG400/水，10/50/40或乙醇/Solutol/水，10/10/70，最佳载体为基于溶解度数据选择，以确保化合物材料以溶液的形式应用，和（ii）由0.5%Tylose溶液组成的悬浮载体，其中相应的化合物以微粉化材料的形式悬浮。在给药后24小时内收集血浆样本，并通过LC/MS/MS进行分析。使用标准PK软件根据血浆浓度-时间曲线估计药代动力学参数。Frel，susu/sol计算为从混悬液与溶液组获得的AUC比率。基于与Frel，悬浮/溶液的回顾性比较，在人类中获得的数据，在大鼠中具有Frel，悬浮/溶液值大于50%的原料药符合常规IR片剂制剂的开发条件，而对于具有Frel悬浮/sol的原料药值小于50%，则表明了启用制剂（EF）的开发（图1）。
2.1.2.Bayer SWOT分析
临床1期研究的API配方选择首先在开发候选选择阶段形成，为其生成全面的体外和体内数据集。该分析包括深入的物理化学、药理学、DMPK和毒理学表征，作为决定哪种候选药物将进入临床前开发的基础[25]。
关于候选药物是否适用于传统的IR片剂制剂或是否需要EF开发的决定是基于决策树（DT），该决策树结合了体外和体内数据，例如（i）表征良好的微粉化化合物材料的水溶性，（ii）化合物的预测人类有效剂量，和（iii）以mg/kg为基础的人类等效治疗剂量在大鼠（雄性，禁食）中以混悬液/溶液的形式给予的表征良好的微粒化化合物材料。该数据用于如上第2.1.1节所述的决策。
DT的优势来自于基于20多种内部化合物的临床验证，这些化合物已经生成了人体Frel固体/溶液数据（IR片剂与液体制剂）和大鼠的Frel悬浮/溶液数据。根据所使用的数据集，推荐使用常规IR片剂或EF开发的大鼠的临界Frel、susu/sol值已定义为50%[5]。DT的另一个优势是使用实际药物开发候选物的预测人类治疗剂量，即非标准剂量，用于大鼠的Frel、susp/sol研究，并计算在人类中溶解该剂量所需的体积[21]。在不同pH值的水性缓冲液中测定溶解度，并测定在该开发阶段与API在IR片剂中尽可能接近的化合物状态，即平均粒径d50<10µm的规定晶体材料。DT还适应化合物的电荷状态，即它们在GIT的不同部分中的中性、碱性或酸性程度。该信息与预测的人类治疗剂量的使用一起用于估计给定候选药物的任何潜在溶解度受限和/或溶出受限吸收问题。此外，还通过以溶液形式给药的化合物的临床前物种的绝对口服生物利用度和体外Caco-2测定中的渗透行为来评估人体的口服吸收行为，以确定任何渗透性有限的吸收问题。
DT已成功应用于多个适应症的许多药物发现和开发项目，但承认其局限性对于每个新药开发候选药物的配方重新表彰的可靠性至关重要。其中一个方面涉及大鼠Frel，susu/sol研究中的溶液组，其中必须确保化合物完全保留在溶液中，即不会在体内GIT中沉淀，从而导致过高估计Frel，Susu/sol值。因此，在进行体内研究之前，需要非常谨慎地选择大鼠Frel、混悬液/溶液the solution arm的配方。首先，必须确定能够实现化合物最高溶解度的制剂。然而，由于过饱和溶液倾向于在体内的GIT中沉淀，因此作为第二步，还必须在体外沉淀测定中测试该制剂，以确定其在体内研究中对溶解度solubility arm的适用性。DT的另一个限制涉及Muenster及其同事[4]在出版物中使用的化合物组的人体剂量范围。所用数据集中的大多数化合物都是以低于200mg的人体剂量施用的。当对预计人体剂量超过该剂量范围的化合物使用DT时，需要考虑这一点。对于这类化合物，在生物相关介质中增加剂量的体外溶出试验具有特别重要的意义，以便能够预测人1期剂量递增的不同剂量步骤的吸收行为[21]。虽然过去的决策主要基于水性缓冲液中的溶解度估计，但现在越来越多地通过从生物相关介质中得出的估计来实现[22]。此外，基于生理学的口服吸收模型也越来越多地支持项目支持和决策[23-26]。
2.2.勃林格殷格翰
2.2.1勃林格殷格翰当前决策树
在勃林格殷格翰，可开发性评估是根据溶解度和估计的人体剂量以及各自的剂量数（DN；即（剂量/250mL）/（溶解度））正式进行的。还考虑了其他参数，如渗透率、生物利用度和溶出速率，但未反映在BI决策树（DT）中。
有三种不同的配方方案（A、B和C）。配方方案A用于固有DN（水中DN）<10的化合物。方案A化合物仅作为常规制剂开发，预计不会出现生物利用度问题。固有DN>10的化合物可分为两类。固有DN>10和在FaSSIF<10中DN的化合物被视为方案B，在水中和FaSSIF中DN>10的化合物被认为是方案C化合物。在方案B化合物的情况下，进行更复杂的制剂开发；除了常规制剂之外，还开发了几种含有表面活性剂或有机酸的改良的常规制剂。利用生物相关溶出和体内研究来选择Ⅰ期研究的最佳制剂。最复杂的方案是方案C。与其他两种类型类似，正在开发含有非晶或纳米晶API的非常规配方或EF。在方案C化合物的Ⅰ期，预计将在临床上测试几种制剂（图2）。
2.2.2.勃林格殷格翰SWOT分析（Ⅰ期前）
例如，DN是根据估计的人体剂量计算的。配方原则的决定适用于预期的商业配方。在Ⅰ期的研究中，给予更高的剂量，需要用这些剂量计算DN，以评估这类研究是否需要EF。DN的阈值基于先前化合物的经验，而不是由DN和绝对/相对生物利用度的相关性来确定。需要对此阈值进行内部验证。
决策树仅基于溶解度，Frel研究不作为该决策过程的一部分。如果DN较低，这是一个优势，因为这会导致快速的决策过程，有利于传统配方的开发，并且可以避免动物研究。然而，这可能是一个缺点，因为对上述DN>10的动物研究可能表明，传统配方方法仍然足够好，并且可以避免昂贵的非传统配方开发。在BI决策树中，混合2小时后的动力学溶解度被视为生物相关溶解度，而没有确定热力学溶解度。这使得很难与其他决策树进行比较。
2.3.Bristol Myer Squibb（BMS）
2.3.1BMS当前决策树
在Discovery Development界面，通常在Sprague-Dawley大鼠和Beagle犬中进行动物PK研究，以评估原料药和早期临床制剂的生物药剂学风险。狗模型更常用于配方和剂型的决策，以及评估早期临床试验的生物药剂学风险。
配方开发计划取决于临床候选药物的BCS类别。根据早期动物研究中使用的最高剂量（如Frel大鼠或毒理学）的渗透性（Caco-2和PAMPA）和溶解度进行初步分配。早期的临床前研究包括大鼠口服药物溶液制剂的绝对生物利用度评估，然后是混悬液制剂的相对BA。如果结晶混悬液的BA相对于溶液制剂大于50%，则无论BCS类别如何，都会考虑片剂或胶囊开发的常规制剂方法。然而，如果混悬液的BA＜50%，特别是对于BCS-II或IV化合物，则可能采用启用的API（例如高溶解度盐形式、共晶或尺寸减小的API）或启用的配方（EF）方法（例如无定形分散体或增溶体系）。基于理化性质和预配方研究，可以使用专门的生物相关体外溶出度研究和狗PK研究来进一步了解生物药剂学风险，如食物效应、对pH调节剂的敏感性以及临床相关剂量下低BA（如胃不稳定、润湿性差或初始溶出度差）的风险。这些生物相关工具的使用及其与临床前和临床PK的联系已在之前发表[28，29]（图3）。
2.3.2.BMS SWOT分析
决策过程以API的生物药剂学风险为基础，考虑临床剂量、物理化学数据和一系列生物相关性（SGF、FaSSIF和FeSSIF）体外溶解数据、体内药代动力学和计算机建模活性。配方决策过程的强度取决于卫生机构认可的BCS类别的通用指定，以及相对简单的要求，即相对于溶液配方达到50%的生物利用度阈值。几年来，这已应用于每一个临床发展候选者，并在FIH临床PK数据可用后通过回顾性分析和对控制风险因素的额外机制理解不断验证。
在早期临床配方开发中，狗研究主要用于测试API和配方选择，原因与之前描述的相同。五肽胃泌素和法莫替丁的预处理用于控制狗固有的可变胃pH值，并复制更像人类经验的条件。然而，在这个早期阶段，当采用这种简单化的方法时，存在一些未知因素。例如，API晶体性质（最终形式）可能尚未最终确定，粒径的影响也不完全清楚；剂量范围可以显著变化；并且某些以患者为中心的生物药剂学风险，例如对pH效应和/或食物效应的易感性，可能会出现影响制剂选择的风险。为了应对这种不确定性，使用生物相关溶解模型和计算机PBPK模型来衡量风险的严重性，并可能证明需要进行额外的动物PK测试。
2.4.杨森
2.4.1杨森当前决策树
在早期开发中，通过临床前研究来指导配方选择，确定药物在Sprague-Dawley大鼠或Beagle犬的溶液（Fabs，sol）和Frel，susp/sol中的绝对生物利用度[14]。PEG400和环糊精通常用作口服溶液制剂中的增溶剂，而甲基纤维素通常用作悬浮剂。该临床前混悬液/溶液生物利用度研究中的常用给药剂量为标准剂量，例如大鼠为5mg/kg，狗为10mg/kg。
该研究的结果可以提供一种指示，说明临床研究必须开发哪种制剂类型。对传统技术、增强技术或EF技术进行了区分，因为它们决定了开发成本和时间表。常规配方是指没有经过深思熟虑来改变药物溶解性、释放/溶出速率、渗透性和/或稳定性（例如直接压缩、干/湿法制粒、灌胶囊技术）的配方。
提高溶解性或渗透性的配方使用常规技术来分别提高API的溶解性/溶出（例如盐形式、包含溶解度或溶解增强辅料）或渗透性（例如添加渗透促进剂）。当使用复杂的制造技术（例如固体分散剂、纳米混悬液、基于脂质的系统）来提高API的溶解性/溶出时，使用“溶解性EFs”一词。
对于具有高Frel，混悬液/溶液（≥0.8）的化合物，当Fabs，溶液高（≥0.7）时，或者当Fabs溶液低时，由于高的首过效应，可以开发常规的模拟。在Fabs溶液是低的情况下，分别由于溶解的API的低Peff或沉淀，提出了提高渗透性或提高溶解性/EF。对于具有低Frel、混悬液/溶液的化合物，当Fabs、溶液较低时，应考虑溶解度EFs，而当Fabs，溶液较高时，可能适合使用溶解度增强制剂。如果已知或估计临床DN较低，则在提出溶解度增强或使能技术的情况下，可以开发传统制剂（图4）。
2.4.2.杨森SWOT分析
使用杨森化合物的广泛数据库（主要是弱碱，logP>2，肠道人体有效渗透率（Peff）>2*104cm/s）验证了DT，表明狗的临床前数据与化合物的BCS分类和开发的临床制剂类型非常一致，而大鼠的临床前数据则不太清楚[14]。在验证数据集中，大多数大鼠数据是在进食状态下生成的，而大多数狗数据是在禁食状态下生成。与狗相比，由于大鼠的永久性胆汁引流和狗的食物诱导胆汁分泌，大鼠肠道中的平均胆汁浓度更高，这可能至少部分导致了这些观察结果。
进行体内研究的优势在于，它们能够评估化合物溶解度和渗透性对药物暴露的综合影响。这些研究通常有多种用途，包括对药代动力学的初步了解和毒理学研究的准备，以及制剂类型的选择。通过在分离过程的早期生成和评估Frel、susp/sol和Fabs、sol，并结合一些体外读数（如渗透性、沉淀测试等），创造了理解机制的机会。基于体外数据的计算机模拟也可以应用，但模型构建需要大量的时间投资，建议根据体内数据进行验证。
由于仅基于体外和/或体内动物药理学模型时，在发现和临床前研究阶段进行的治疗剂量估计具有不确定性，因此建议的临床前生物利用度研究是用标准剂量进行的。然而，该剂量可能不能反映预期的临床剂量。如果已知临床剂量与建议的标准剂量有显著偏差，则可以使用更具代表性的剂量进行临床前研究。
人们认识到，API的颗粒大小和物理形式以及溶液和混悬液的辅料会影响所测试化合物的溶解度和/或溶出行为，从而影响体内生物利用度研究的结果。如果这些参数在开发过程中发生变化，则必须评估对配方类型的影响。
3.与API决策树的相互作用（药物的体外表征）
药物开发决策树是OrBiTo项目中物理化学工具的结果，基于几种新的小规模生物相关体外工具，开发这些工具是为了表征NCEs的物理化学性质，从而评估是否需要EF方法。在DT的第一步中，建议使用一组模拟肠道介质来确定NCE的溶解性，该介质是通过应用实验设计（DoE）开发的，以确保在GIT中可能遇到的所有相关的肠道内流体成分都是可溶解的。使用这种DoE方法，可以确定哪些因素驱动NCE的溶解度，例如pH、胆盐、磷脂、单甘油酯等，这也可以指示哪种模拟方法适用于给定的NCE。DoE溶解度数据将得出每个选定剂量的NCE的剂量数范围，进而可用于进一步评估NCE的开发策略。
如Andersson等人[30，31]所述，如果一个或多个剂量数高于1，则建议进行小规模的固有溶出研究（IDR）。根据NCE的溶解度，可以使用圆盘、粉末或受控混悬液。控制NCE颗粒的大小能够评估颗粒大小对溶解给定剂量的NCE的影响。这将告知是否可行将颗粒尺寸减小到在可用于吸收的传输时间内完全溶解的水平[30]。
在不可能通过减小颗粒尺寸来实现完全溶解的情况下，可以探索NCE的过饱和倾向。为此，开发了一种小规模标准化体外超饱和沉淀法（SSPM）[40]。简言之，将NCE溶解在DMSO中，并以四种不同浓度过量添加到生物佐剂介质中。这使得能够在四个标准化条件下消除最大过饱和度、沉淀前的诱导时间和沉淀速率。由此，可以确定过饱和倾向。此外，SSPM还可用于筛选不同辅料延迟沉淀或降低沉淀速率的能力。
为WP1描述的物理化学DT与当前提出的“决策图/策略”有几个接口，提供了NCE物理化学性质的信息，从而能够更好地决定选择哪些动物研究。首先，基于DoE方法获得的剂量数可以很容易地作为公司用于决策的剂量数。此外，IDR研究可以增加关于是否需要进行体内Frel、susp/sol研究的进一步信息。过饱和倾向可能会影响小样本体内沉淀的风险，也会影响配方开发方法的选择
4.建模与仿真（M&S）在开发过程中的作用（WP4——体内数据的计算机建模工具）
近年来，使用基于生理学的药代动力学（PBPK）软件或其他类型的建模与仿真工具进行建模与仿真的作用对NCEs的开发变得非常重要，特别是在使用任何给定开发计划中的研究得出的临床数据的后期开发中。
特别是PBPK的使用在早期制剂开发过程中可能非常有用。通常，如果有足够的体外参数和物理化学信息可用，建模可以提供有用的信息，或者至少可以深入了解哪些参数对进一步的配方优化最重要。此外，这些模型可以改善和/或证实对胃肠道中发生的事情的机制理解。它们在早期配方设计中的价值在于提高早期动物模型用于参数敏感性分析的有效性，并在有更多临床数据可用的开发后期提供模拟方案的能力。随着更多人类临床信息的收集，应继续在这些模型的开发过程中进行改进。
作为一个群体，我们不推荐任何特定的软件，但建议科学家遵守卫生当局提出的PBPK软件的验证指南。
最终，在早期配方工作中使用M&S或PBPK建模现在正成为一项标准活动。从历史上看，主要的缺点是PBPK模型的复杂性和缺乏在动物物种中进行适当建模的数据。EFPIA公司仅在人体细胞系中进行渗透性实验或对人体组织进行酶研究并不罕见。因此，例如，这将使在大鼠身上建模变得非常困难，而且内部对进行此类实验以支持在动物身上建模的价值存在很多争论。随着更新、更用户友好的软件和药物计量专业知识的激增，作者们一致认为，即使在早期发现中这样做是有成本的，也不能低估建模的价值。许多化合物由于无法在动物体内实现Frel或Fabsolute而失效。这是开设一门不直接关注人类发展的课程的一个小原因。在早期发现过程中，确定动物模型中渗透性或代谢周转等参数的高通量方法对于提供最佳信息作为开发新化合物及其制剂的基础来说是一个很小的代价。
5.体内和理化因素
5.1大鼠
制剂开发的典型strains是Sprague-Dawley或Wistar大鼠。在大鼠中，液体微量取样（包括干血点）现在可以评估个体内测试，并且可能使用相同的动物进行静脉给药，以获得与狗相同的绝对生物利用度。主要关注的是基于维持大鼠体重和年龄所需半衰期的冲洗时间。血容量问题通常不是DBS或液体微量取样的混淆因素[32]。体内大鼠研究可能包括每个治疗组的动物数量，范围从3到6，这取决于API的可用性和检测给定API/BCS类别差异的统计能力。
在我们的比较中所代表的研究在进食状态方面是混合的。例如，拜耳在大多数研究中使用禁食大鼠，而杨森在体内研究中使用喂养动物。
一般来说，大鼠通常的禁食时间为夜间~16小时。另一个考虑因素是，与狗或人相比，大鼠在肠道中的胆汁盐浓度更高（可能与胆囊的存在导致的持续胆汁流有关）[12]。然而，很明显，大鼠和狗之间存在生理差异，这可能解释了这两个物种之间的一些差异。
5.2.狗
一般来说，比格犬因其体重较低（～10公斤），在早期研究中被用作配方开发的犬种[15]。根据OrBiTo缺口分析[11，33]，狗倾向于过度预测BCSIII类化合物的人体生物利用度。根据大鼠和狗Frel、混悬液/溶液生物利用度数据的比较，Janssen观察到了相反的情况，但得出的结论是，狗比大鼠更善于区分制剂类型选择[14]。
一般来说，如果在交叉设计中使用相同的狗，早期阶段配方实验中使用的狗的数量取决于化合物的半衰期，以确定冲洗期。在狗身上使用交叉设计可以最大限度地减少个体间的差异，并允许个体内的比较。使用的狗的数量最终将由测试的化合物的数量、给定化合物的API可用量以及动物之间的变异性（如果从其他体内研究中已知）决定。此外，研究表明，狗胃的pH值显著高于人类胃的pH[5，16]。因此，许多作者使用五肽胃泌素（肌肉注射6mg/kg）或每次口服1NHCL进行预处理。许多研究人员使用简单的pH测试条以及更复杂的工具，如SmartPill®[5，10，11，17]，对胃pH进行了测量。有条件的是，在文献中，狗体内肠道转运蛋白的分布几乎与人类的情况相似[41，42]。狗通常在给药前禁食。在生物等效性研究中，一些公司在服用片剂后服用50毫升自来水，与人体服用250毫升自来水成比例。
5.3.其他物种和信息
非人类灵长类动物也被用于文献中的体内研究，假设它们与人类最相似[34]。然而，动物的治疗指南和灵长类动物的喂养习惯与人类的情况有很大不同[33]。小型猪也被用于体内实验。这两个物种都可能具有在相对生物利用度试验中使用的适用性，但动物饲养和3Rs的考虑有利于使用狗或大鼠[35]。
哪种制剂载体可用于每种物种，可能受到其与所用物种相互作用的限制。例如，PEG增加了大多数动物体内肠道的水量，这可能会影响肠道的通透性。在体外观察到PEG400对外排转运蛋白的抑制作用；然而，这一事实尚未在体内得到实验证明[36，38]。
5.4.化合物信息：主要性质、溶解度和溶出度
如果我们深入研究表征药物的具体方法，很明显，一些特征是化合物的固有特征，如酸性或性质的分类。因此，这些特征是独立于方法的，不是目前讨论的主题。
另一方面，其他特征可以以各种方式来表征，并且结果可能强烈地取决于具体使用的方法。关于该配方，许多公司通过获得有关该化合物溶解度和溶出特性的早期信息来开始决策过程。
溶解度测定可在两种常见介质中进行：水性介质和生物相关介质。利用水性介质对不同pH值下的溶解度进行了基本概述，总体生理范围约为pH1-8。然而，众所周知，这些纯水性介质仅以有限的方式反映GIT内生理条件的性质[27]。生物相关介质，如SGF、FaSSIF和FeSSIF，旨在更密切地反映体内胃肠道条件，并由体内存在的几种其他成分组成，如胆汁盐、磷脂或更多的体内相关盐。这些媒体大约在20年前就开始实施了。正在进行的进一步衍生物的评估和开发，不仅针对人类条件，也针对不同动物物种的条件，表明了这种体外工具的至关重要性。OrBiTo[39，40]的工作包1中对生物相关介质的不同成分对溶解度的复杂影响和相互作用进行了更深入的研究。第3节更详细地描述了与工作包1的交互。
在EFPIA合作伙伴中，水性介质可以作为了解溶解度的开始，但生物相关介质也广泛用于确定溶解度，并在此基础上进行DN计算。
在比较不同EFPIA合作伙伴的方法时，注意到他们中的大多数人更喜欢在溶液沉淀之间的稳态下和沉淀的平行溶解之间进行溶解度测定，从而确定热力学溶解度。搅拌混悬液后达到这种稳定状态的时间可能高度依赖于化合物，但通常使用24或48小时的时间框架作为粗略估计来确定热力学溶解度。一些EFPIA合作伙伴更喜欢更短的溶解度测定时间框架，如2或4小时，这更好地反映了GI的传输时间。在大多数情况下，没有达到溶解度浓度的稳定状态，因此该程序将用于确定更多的动力学溶解度。与热力学溶解度相比，该程序更多地依赖于化合物的粒径，但考虑到过饱和和缓慢溶出程序，可能更好地反映相关的体内浓度，并且可能更适合后续的PBPK计算。
5.5.决策工具：剂量数和动物研究
大多数EFPIA合作伙伴普遍认为，常规或EF之间的决策是一个两阶段的过程，DN的计算和动物研究作为工具。
DN的计算基本上是药物化合物相对于剂量的溶解度的结果。溶解度在前面的章节中进行了详细讨论，正如概述的那样，可以讨论本次评估推荐的溶解度。这也是一个关键的问题，采取何种剂量进行计算。在EFPIA合作伙伴的策略中，关于这一主题存在不同的想法，但基本上它们围绕着一个问题，即是服用标准剂量，还是在估计的治疗范围内服用预先预测的剂量，还是一种“最坏情况”剂量，这是由于在Ⅰ期进行的耐受性研究而产生的最高剂量。由于候选药物的知识不断发展，剂量预测很复杂，因此这是一个不断变化的目标，很可能是一个变化的问题。将剂量预测调整为更高的药物量可能很容易导致从非常合适的DN转变为不合适的DN。另一方面，使用标准剂量可以避免DN评估的变化。然而，许多其他药物领域都使用不同的剂量。由于在心血管疾病等已经研究得很好的治疗领域具有很高的临床标准，较低剂量更为常见，可能是候选药物成功的重要因素。相比之下，对于更严重和危及生命的疾病，以及对肿瘤治疗等新治疗方法的高需求，有更高的耐受性和更高的剂量。标准剂量应考虑到各种治疗标准的这些差异。
另一个主题也是Ⅰ期试验中的剂量递增，以获得有关候选药物耐受性的信息。传统的IR制剂可以在较低剂量下工作，但对于较高剂量，可能需要EF。开发两种不同的配方不仅需要加倍的努力，而且与剂量相似的传统配方相比，EFs的开发可能更复杂、更耗时。赞助商实验室内确定临界值的统计数据将取决于在进入体内动物研究之前可以在体外测量的额外变量。
剂量数是一种简单方便的方法，可以了解传统配方足够生物利用度的可能性。在OrBiTo数据库中，有许多不同公司的DN计算示例（见表1）。EFPIA合作伙伴之间的直接比较是困难的，因为每家公司都根据上述使用剂量和溶解度的差异以自己的方式评估DN。在所示的决策树示例中，经常使用的、因此得到认可的DN截止值为10（见第2节）。对于较高的DN，大多数公司的决策基于体内动物研究结果的配方策略。
5.6.其他需要考虑的因素
在使用体内模型时需要考虑的其他因素可以描述为进行任何制剂评估之前的最低标准。这些因素是使用人体细胞系的体外渗透性，用于配方评估的动物物种的静脉（IV）药代动力学数据（以计算绝对生物利用度和估计的有效人体剂量和/或“I期耐受性的最坏情况剂量”），可以通过异速测定法或PBPK模拟进行建模。最终，这些因素、要使用的物种和物理化学特征的组合可以提供足够的信息来确定是否应该在动物物种中进行Frel、susp/sol。
在进行初步PK研究以根据决策树做出配方决策后，在进行临床试验的过程中往往会出现变化。例如，剂量可以改变，配方策略可以改变（例如，切换剂型，禁食至喂食条件，或将受试者纳入pH调节剂），API特性可以随着放大而改变（例如新的更稳定的多晶型、盐或优选的粒径范围）。可能不需要对所有这些变化进行PK研究，只需要对那些存在溶解/吸收改变风险的情况进行PK研究。当PBPK模型清楚地表明对PK没有影响，并且生物相关的溶解支持剂量的完全溶解时，动物PK研究就成了多余的。这更有可能适用于BCS-1和3类药物。
6.OrBiTo化合物的剂量数评估
如上所述，早期决策树或策略是在获得临床数据之前进行制剂开发的决策树或战略。4家EFPIA公司收集的信息如表1和图5所示。
在Spotfire和Excel中使用针对大鼠的Frel、susp/sol的各种参数进行线性回归分析。在任何pH值下，无论是否存在DN的对数转换，都没有发现不可分辨或显著的相关性（图5R2=0.02）。
7.结论
在这项工作中，回顾了4家EFPIA公司早期配方开发方法的不同策略。显而易见的是，目前还没有结论表明哪种方法更可取。尽管这些方法在许多细节上有所不同，如剂量预测的整合或用于体内研究的动物物种，但每个DT都由相似的关键元素汇编而成。因此，在更广泛的背景下，每家公司都从相似的参数中得出其配方决策，这些参数可以用不同的方式进行评估。每种方法都有其自身的基本原理，在每家公司的特定环境中都有意义，比如实验室环境和战略。通过这种方式，建立了一个内部数据库，用于比较历史数据和当前数据。这项工作没有调整单一的方法，从而失去其独特的优势和机会，而是试图总结对早期制定战略至关重要的最重要的关键要素，因此，在单一决策树中预先发送（图6）。
总体而言，每个DT都从分析药物的物理化学特征开始，如固态性质和溶解度。在下一步中，溶解度和剂量（DN）之间的关系将发挥作用，如果认为有必要，将通过靶向应用途径在动物中进行首次探索性生物利用度研究。这些工具有助于做出关于开发常规还是EF的配方决策，并成功应用于不同赞助商的药物开发。
然而，观察到Frel与DN之间缺乏相关性（图5），可能提出了几个原因。第一个可能的理由是，每个实验室的实验条件不是以第2.2.1节中所述的类似方式进行的。第二个考虑因素是，在确定这种相关性时可能有多个因素在起作用。最近在狗身上观察到了这一点，其中许多物理化学参数对于描述PBPK模型范式中Fa数据的最佳拟合（观察到的与预测的）是必要的[42]。第三个可能的原因是，单一的物理化学性质不能充分描述整个化学空间。在这篇手稿的准备过程中，作者没有考虑空间的结构或指示。对于任何一个特定的赞助商来说，将几种类似的化学物质带到动物粪便中并不罕见。此外，没有理由相信结构系列代表了一个宽或窄的化学空间。
因此，很难定义一个跨公司和不同化学类别化合物的总体决策树/战略。因此，建议对于每个项目，即化学多样的一组化合物，都需要验证决策树，并定义可用于该任务的最合适的工具。
这篇综述试图为基于理化特性和/或动物PK研究的制剂选择决策过程提供一种一致的方法。它概述了在发现-开发界面上需要考虑的一些标准，其中变量数量很高，并且在临床研究之前存在不确定性。
