IF=64.8 一区！线粒体复合体I通过促进ROS产生介导神经炎症的发生

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本次介绍的这篇刊登在Nature（IF=64.8 一区）上的文章：“Mitochondrial complex I activity in microglia sustains neuroinflammation”，主要讲述的是小胶质细胞中的复合物 I 活性是促进中枢神经系统慢性炎症性疾病神经保护的潜在治疗靶点。

研究背景

在多发性硬化症 （MS） 中，以病变边缘骨髓细胞积聚为特征的慢性活动性、缓慢扩张、闷烧性病变与脑萎缩有关，并预测不可逆残疾的积累，进而推动疾病进展。在这些病变中，持续活化的髓系细胞是神经毒性因子的持续来源，包括肿瘤坏死因子 （TNF）、白细胞介素-1β（IL-1β）、一氧化氮 （NO） 和活性氧（ROS），导致髓鞘再生失败和继发性神经元/轴突损伤。在多发性硬化症样疾病模型中，轴突损伤后是代偿反应，即脱髓鞘轴突中的线粒体含量和活性增加以促进神经保护。相反，神经元线粒体复合物和能量代谢的缺陷与持续的轴突损伤、灰质萎缩和多发性硬化症疾病进展有关。

已知线粒体呼吸复合物和代谢物可控制骨髓免疫反应。先前的体外研究表明，在炎症条件下，髓系细胞中细胞内琥珀酸水平升高会促进从沿呼吸链的正常正向电子传递转变为通过线粒体复合物 I （CI）的反向电子传递 （RET）。这种机制需要高质子动力，有效地将线粒体从三磷酸腺苷 （ATP） 的产生转向产生超氧化物，从而形成过氧化氢和其他 ROS，统称为线粒体 ROS （mtROS）。

可逆抑制剂衣康酸或丙二酸抑制琥珀酸脱氢酶（也称为线粒体复合物II，CII）限制RET诱导的mtROS产生，并在体外促进髓系细胞的抗炎作用。同样，阻断 CII 或 CI 活性可防止体内梗死心脏再灌注过程中 RET 介导的 mtROS 损伤。然而，线粒体复合物在闷烧性炎症性中枢神经系统 （CNS） 疾病的背景下在延续小胶质细胞活化中的作用在很大程度上仍未得到探索。

主要研究结果

📢小胶质细胞在 EAE 期间显示线粒体 CI 表达增加

为了研究小胶质细胞和中枢神经系统浸润髓样细胞合作维持中枢神经系统炎症的分子机制，该研究使用了基于体外单细胞RNA测序（scRNA-seq）和液相色谱-质谱（LC-MS）的Cx3cr1-YFP分析creERT2型R26型td番茄命运映射小鼠，用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白肽 35-55 （MOG35–55）诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）。scRNA-seq数据显示，A-EAE小鼠中浸润性髓系细胞的流行率很高，而小胶质细胞在对照组和C-EAE小鼠中占主导地位（图1a），这与支持小胶质细胞差异细胞转录状态的证据一致。

在A-EAE小鼠中，hMG样细胞的比例下降到所有分离细胞的不到1%，随后在C-EAE小鼠中增加到36%，因此表明在疾病的慢性阶段部分恢复体内平衡。该研究的方法还确定了疾病相关小胶质细胞 （DAM） 的几个集群（即集群 3、4、5、7、8 和 10）在对照组小鼠中几乎不存在，在A-EAE小鼠中增加，在C-EAE小鼠中持续存在（分别占所有分离细胞的8%，46%和48%）（图1b）。

图1.小胶质细胞在EAE过程中表现出线粒体CI表达增加。

鉴于持续性 DAM 活性在慢性中枢神经系统疾病中的潜在致病作用，该研究对小胶质细胞进行了聚类分析，以进一步了解它们在病程中的活化特征和动态。然后，该研究分析了RNA表达变化的速度和方向性在不同的单元格中（图 1c）和小胶质细胞集群。在所有DAM簇中，DAM簇4是唯一一个从对照组到A-EAE再到C-EAE持续增加的簇（分别占DAM的6%、23%和29%），并且它显示出向其他小胶质细胞簇转变的概率最低，提示EAE中的持续状态。在转录方面，DAM 簇 4 的特征是 DAM 基因表达增加Spp1、Cd63、Cst7、Timp2 和 Apoe、Cd63、Cst7、Timp2 和 Apoe（图 1d）。

该研究对 DAM 簇 4 进行了额外的转录组学和亚聚类分析，以确定驱动其在 EAE 中持续存在的假定机制。该研究发现 DAM 簇 4 进一步表征了与GO项相关的糖酵解（例如 Gapdh 和 Aldoa）和氧化磷酸化（例如 Cox4i1 和 Ndufa1）相关的 DEG，而子聚类分析确定了三个主要的子聚类（图1e）。DAM 亚簇 4.1 和 4.3 的 GO 项分析显示，参与髓系活化和代谢物信号传导的几种通路富集（图 1f ）。相反，DAM 子簇 4.2 的特征是与电子传递链、线粒体 CI 功能（NADH 到泛醌）和针对电化学梯度的能量耦合质子传递相关的途径。鉴于 CI 和 CII 在促炎性髓系细胞中电子传递和 ROS 生成中的已知功能作用，进一步分析了编码这两种线粒体复合物的基因。发现与表达氧化应激标志物GP91-PHOX的SPP1RFPYFP在C-EAE小鼠中小胶质细胞的显着增加有关。

📢髓系细胞的体内外分析表明，EAE 中的能量代谢、氧化应激和线粒体功能发生了变化

为了研究这些小鼠数据与人类疾病的相关性，该研究重新分析了两个独立的公开可用的单核RNA-seq数据集，这些数据集来自MS患者和对照组的尸检。因此，该研究的研究确定了一组持续激活的 DAM，这些 DAM 具有高表达的 CI 基因和蛋白质，这些 DAM 在小鼠的 C-EAE 期间持续存在，并且几乎只在进行性 MS 患者的 CAL 边缘发现。

为了进一步了解维持慢性中枢神经系统炎症的小胶质细胞和浸润性髓样细胞的代谢特征，该研究接下来对体外分离的髓样细胞的细胞内代谢组进行了LC-MS分析。脊髓切片的激光解吸-快速蒸发电离质谱 （LD-REIMS） 分析证实，衣康酸盐和抗坏血酸在原位白质炎症浸润中的丰度更高。对整个LC-MS数据集的分析显示，衣康酸水平与抗坏血酸以及脱氢抗坏血酸之间存在直接相关性（图2c-e）。

图 2.骨髓细胞的离体分析显示EAE中能量代谢、氧化应激和线粒体功能的变化。

为了将这些代谢变化与scRNA-seq数据集中相关基因的表达相关联，该研究专注于从对照组和EAE小鼠中分离的小胶质细胞簇。该研究的scRNA-seq数据集的重新分析表明，正向调节线粒体自噬的基因35C-EAE与A-EAE小胶质细胞的减少。因此，基因调控网络引导线粒体自噬在DAM簇4中下调，而引导CI转录的基因调控网络上调。为了将这些代谢和转录特征与线粒体复合物的功能联系起来，该研究在疾病的不同阶段应用了离体代谢通量分析，发现与对照组和 A-EAE 小胶质细胞相比，C-EAE 小胶质细胞的 CI 和 CII 活性水平显着更高（图 2j）。

为了进一步研究线粒体CI是否通过RET作用来放大持续性闷烧样炎症性中枢神经系统疾病中的氧化应激，该研究接下来将RET诱导（RET）的体外模型应用于促炎小鼠小胶质细胞。这些数据表明，CI 在体外 RET 期间作为促炎小胶质细胞中 mtROS 产生的枢纽。为了测试RET促炎啮齿动物小胶质细胞的致病作用，该研究接下来使用避免细胞间接触的transwell共培养系统将它们与SH-SY5Y神经元细胞共培养，证实了ROS在小胶质细胞神经毒性中的主要作用。

该研究进一步验证了从小鼠小胶质细胞获得的人诱导多能干细胞 （iPS） 细胞衍生诱导小胶质细胞（hiMGs） 的主要发现。与对照组相比，RET促炎性hiMGs在SH-SY5Y细胞中产生显着更多的mtROS，线粒体膜电位增加，并导致神经突毒性增加。如小鼠小胶质细胞所述，这些作用都是通过鱼藤酮治疗在 hiMG 中抑制 CI 来阻止的。因此，通过CI抑制阻断促炎啮齿动物和人小胶质细胞中的RET可以在体外防止过度的mtROS相关神经毒性。

📢小鼠 Nd6 点突变可阻断 RET 并改善 EAE

为了进一步确定CI和RET在小胶质细胞极化和功能中的作用，该研究接下来从Nd6小鼠中分离出原代小胶质细胞。这些小鼠携带线粒体CI基因Nd6中的点突变，该突变阻断RET，同时保持正常的正向电子传递。用 LPS 和 IFNγ 刺激小胶质细胞诱导野生型（WT）和 Nd6 小胶质细胞中编码主要促炎细胞因子的基因表达的叠加效应，而刺激的 Nd6 小胶质细胞显示出显着更高的线粒体 ATP 产生。Nd6小胶质细胞没有增加mtROS的产生（图3b）或在与SH-SY5Y细胞共培养时引起显着的神经突毒性（图3c）在体外条件下，迫使RET在小胶质细胞中。

图3.Nd6小鼠点突变阻断RET并改善EAE。

为了验证这些发现在体内疾病模型中的相关性，该研究诱导了MOG35–55Nd6 和 WT 小鼠中的 EAE。发现参与抗原加工和呈递的溶酶体基因表达增加（例如，Ifi30 和 Ctss），但没有与生长因子活性相关的显着 DEG。接下来，该研究从非免疫对照和EAE小鼠中分离CD45Cd11b髓样细胞，以评估其线粒体膜离体电位（图3h）。在未免疫的对照小鼠中，该研究发现 Nd6 组和 WT 组之间的线粒体膜电位没有差异。在EAE中，与WT小鼠相比，从Nd6小鼠中分离的髓样细胞具有显着降低的线粒体膜电位。因此，Nd6小鼠中RET的缺乏积极调节小胶质细胞对神经炎症的反应，从而导致体内氧化应激的减少。

📢体内靶向 RET 可改善 EAE 并减少继发性轴突损伤

为了研究仅在 A-EAE 和 C-EAE 之间的过渡期间治疗靶向髓样细胞中 CI 的可能性，该研究接下来构建了Ndufs4-KO小鼠。该研究发现，与Ndufs4-WT EAE小鼠相比，Ndufs4-KO EAE小鼠在达到C-EAE阶段时的疾病严重程度显着降低。在未免疫的对照小鼠中，Ndufs4-KO小鼠在簇3少突胶质细胞中略有减少（1.1倍），在簇0小胶质细胞中增加（2.6倍），其特征在于参与细胞骨架组织的基因，如β肌动蛋白（Actb）和胸腺素β-4（Tmsb4x)（图4b）。这与该研究的scRNA-seq数据集中发现的调节细胞骨架组织的基因差异一致。因此，在体内靶向髓系细胞中的 CI 活性可增加 hMG 样细胞并诱导 DAM 变化，从而共同防止氧化应激和相关的神经毒性。

图4.体内靶向RET可改善EAE并减少继发性轴突损伤。

接下来，该研究在小鼠和人类小胶质细胞中进行了体外药物测试，以选择CI和CII活性抑制剂进行体内测试。CI抑制剂鱼藤酮和二甲双胍以及CII抑制剂丙二酸二甲酯（DMM）和丙二酸二钠在体外减少mtROS的产生最有效。通过选定的CI和CII抑制剂的组合，进一步增强了这种效果。

研究结论

尽管线粒体在 MS 中的作用在神经元中被广泛描述，该研究确定了一种关键的线粒体机制，该机制通过维持小胶质细胞激活和神经毒性损伤来促进中枢神经系统炎症的延续。

从机制上讲，该研究表明，通过用小分子阻断 CI 或使用没有 RET 的 Nd6 小胶质细胞，可以在体外阻止这一过程。在体内动物疾病模型中，干扰线粒体CI亚基的功能可促进保护性hMG样表型的获得。这为靶向和解决长期中枢神经系统炎症提供了一条有希望的途径。