NAT10催化ac4C修饰后的ANKZF1促进肾透明细胞癌的淋巴生成和肿瘤进展|期刊CAC2 IF16.2

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研究亮点

1. 研究揭示了在肾透明细胞肾癌中，NAT10催化mRNA的ac⁴C修饰水平显著高于邻近正常组织。

2. 研究明确了ANKZF1作为NAT10的直接功能性靶标，其通过与YWHAE的相互作用，竞争性地抑制YAP1的胞质滞留，从而导致淋巴生成因子的转录激活。

3. 研究提出了NAT10/ANKZF1轴调控的非经典Hippo通路在ccRCC淋巴管生成中的作用机制，为开发针对这一信号轴的新型治疗策略提供了科学依据。

内容简介

淋巴转移是肾透明细胞癌（ccRCC）中普遍存在的一种转移途径，通常与患者预后不良相关。N-乙酰转移酶10（NAT10）是一种催化mRNA的N4-乙酰胞苷（ac⁴C）修饰的酶，它在多种细胞过程中扮演重要角色。尽管如此，NAT10在ccRCC淋巴管生成中的具体作用机制尚未被充分理解。

华中科技大学同济医学院附属协和医院泌尿外科的章小平教授团队，最新研究成果揭示了NAT10在ccRCC发生发展中的重要作用。研究表明，NAT10通过促进新型锌指蛋白（ANKZF1）的ac⁴C修饰，增强了Yes相关蛋白1（YAP1）的核内输入，推动了肿瘤的进展和淋巴管生成。机制研究表明，ANKZF1通过与YWHAE的相互作用，抑制YAP1的细胞滞留，促进下游淋巴管生成因子的激活。总之，本研究阐明了NAT10在ccRCC发生发展中的关键作用，为ccRCC的治疗提供了新的靶点。

图文导读

1. NAT10在ccRCC中表达上调，并催化mRNA发生ac⁴C修饰。

研究发现，在ccRCC的肿瘤组织中，mRNA的总体ac⁴C修饰水平相较于邻近正常组织显著升高。深入分析显示，ccRCC肿瘤组织中NAT10的表达水平也同步升高。为了验证NAT10能在ccRCC中催化mRNA发生ac⁴C修饰，本研究团队构建了NAT10过表达和沉默的ccRCC细胞模型，通过Dot blotting等实验手段，证实了NAT10在ccRCC中确实扮演了ac⁴C修饰的“writer”的角色。

2. NAT10促进了ccRCC的肿瘤进展。

为了评估NAT10在ccRCC中的作用，研究者进行了一系列的体外功能实验。实验结果表明在NAT10沉默的ccRCC细胞中，细胞的增值、迁移和侵袭能力下降，细胞凋亡比例升高。反之，NAT10过表达的ccRCC细胞具有增强的增值、迁移和侵袭能力，细胞凋亡比例减少。此外，在重新引入NAT10后，NAT10沉默细胞的增殖、迁移、侵袭和抗凋亡能力得到恢复。进一步的体内实验证明，NAT10沉默组的小鼠皮下肿瘤体积和重量减少，Ki67的表达也显著下降，肿瘤转移能力减弱。

3. NAT10促进ccRCC的肿瘤淋巴管生成。

肿瘤淋巴管生成对于ccRCC的淋巴转移至关重要。为了探索NAT10是否调节ccRCC中的淋巴管生成，我们首先基于TCGA-KIRC数据集进行了GSEA分析。结果显示，NAT10通过VEGF信号通路参与肿瘤淋巴管生成。进一步的实验表明，NAT10过表达的ccRCC细胞增强促进了VEGFC/D的分泌, 并增强了HLECs的增值、迁移和体外淋巴管形成的能力。反之，NAT10沉默的ccRCC细胞处理HLECs之后，抑制了HLECs的上述功能。体内实验结果显示，NAT10沉默组的皮下瘤中，VEGFC/D的表达降低，同时淋巴管密度也降低。

4. NAT10通过增强YAP1的核定位来促进ccRCC的肿瘤进展和淋巴管生成。

为了阐明NAT10如何促进ccRCC的肿瘤进展和淋巴管生成，本研究在NAT10沉默后进行了RNA-seq分析。结果显示NAT10沉默导致Hippo通路经典靶基因CTGF和CYR61的下调。然而，核心效应子YAP1的表达水平不受NAT10的调节。随后的核质分离实验证实NAT10能促进YAP1核定位。此外，LATS1/2和NF2的敲除部分缓解了NAT10沉默引起的YAP1的胞质滞留。回复实验也证明，YAP1的沉默抵消了NAT10过表达引起的ccRCC细胞的增殖、侵袭和迁移能力的增强，并减轻了其对淋巴管生成的促进作用。RNA-seq和Western blotting结果显示，YAP1的沉默降低了VEGFC/D的表达水平，也抑制了NAT10过表达引起的VEGFC/D的表达上调。综上所述，NAT10通过非经典Hippo通路促进ccRCC的肿瘤进展和淋巴管生成。 

5. ANKZF1被确定为NAT10在ccRCC中的功能靶点

本研究通过分析RNA-seq和NAT10-RIP-seq的数据后发现，NAT10与2395个mRNA结合，其中ANKZF1是NAT10调控的潜在靶标。进一步实验证实了NAT10介导的ac⁴C修饰促进了ANKZF1的表达。ANKZF1的沉默导致ccRCC细胞增殖、迁移和侵袭能力的降低。回复实验表明，ANKZF1过表达可以恢复NAT10沉默引起的细胞功能的抑制，并且抵消了NAT10沉默引起的抗淋巴管生成作用。这些结果提示，NAT10依赖的ANKZF1的ac⁴C修饰调节了ccRCC细胞的生物学过程。

6. NAT10通过增强ANKZF1-YWHAE的相互作用使非典型Hippo信号失活

本研究的前期结果提示NAT10通过抑制非经典Hippo信号通路或上调ANKZF1来促进ccRCC的肿瘤进展。这些发现提示ANKZF1与非经典Hippo信号通路之间存在联系。随后的实验结果提示，ANKZF1与YWHAE直接相互作用，调节YWHAE与YAP1的结合，从而影响YAP1的细胞质滞留。随后，本研究克隆了五个截短的Flag-ANKZF1质粒，并在重新导入HEK293T细胞后进行了一系列的Co-IP实验。结果表明ANKZF1中的600至726个氨基酸是其与YWHAE相互作用所必需的。 

7. NAT10-ANKZF1轴抑制非经典Hippo信号传导，在体内促进ccRCC进展和淋巴管生成

最后，本研究利用体内动物模型探索了NAT10/ANKZF1轴的在ccRCC中功能。小鼠皮下瘤模型表明，过表达ANKZF1可以逆转NAT10沉默引起的生长抑制。IHC染色结果显示，NAT10沉默组中Ki67和VEGFC/D表达水平的降低，在重新引入ANKZF1后得到了恢复。同时过表达ANKZF1可挽救NAT10沉默组中淋巴管密度的下降。免疫荧光染色显示，NAT10沉默组中YAP1核定位减少，在ANKZF1过表之后得到了部分恢复。最后，基于TCGA-KIRC队列进行了Kaplan-Meier分析，结果显示NAT10或ANKZF1的异常积累与ccRCC患者的不良总体生存率相关。综上所述，这些观察结果表明NAT10-ANKZF1轴在ccRCC中促进了肿瘤进展和淋巴管生成。 

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