磁珠分细胞不单纯只有原代细胞的分选

1 磁珠分选细胞原理

磁珠（Magnetic Beads, MBs）细胞分选是一种高度特异性的细胞分选技术，它集成了免疫学、细胞生物学和磁学等领域。用一抗标记的MBs特异性地与细胞表面的相应分子结合，或者用二抗标记的MBs与先前已与细胞表面分子结合的一抗结合。然后，磁珠携带与其结合的细胞，并吸附在分离柱/试管下以实现分离。MBs细胞分选可以在几分钟内从复杂的混合物中分离出非常纯的细胞。当使用纳米级MB进行细胞分选时，其大小和组成将使其可生物降解，而不会激活细胞或影响细胞的活力，并且细胞的生理功能也不会改变。

（图1 磁珠分选活细胞示意图）

2 磁珠分选细胞的应用

从实验室到临床，从小规模到大规模，从普通细胞到稀有细胞和复杂细胞亚群，从人和小鼠细胞到其他种系细胞，MBs细胞分选技术已成为高质量细胞分选的标准方法。此外，由于其优异的特异性和分离效率，MBs细胞分选被广泛用于各种生物医学应用，包括细胞生物学、疾病诊断和药物开发。Tips: 其实在实验室挑选阳性克隆细胞的时候，也能够应用到磁珠分选办法，在过表达/shRNA敲低/CRISPR敲除的重组质粒往往带有标签，例如GFP，此时就能够应用磁珠分选办法将整合了GFP的细胞分选出来。

（图2 磁珠法分选基因编辑后的细胞阳性克隆）

3 磁珠分选方法

分选过程根据MBs的不同结合方式可分为两种：正分选（Positive sorting）和负分选（Negative Sorting）。

3.1 阳性分选

阳性分选使用抗体或配体直接标记目标细胞进行分选。靶细胞被抗体标记并与MB结合，然后置于外部磁场下。由于有标记的MB，目标细胞可以在磁场下被吸收，实现分离。通过阳性分选分离的细胞可以立即用于分析和后续实验。

阳性分选的优点：速度快，操作简单；纯度高，回收率高；分离的细胞可立即用于后续分析或实验。

3.2 阴性分选

阴性分选是指使用抗体偶联的MB来标记非靶向细胞。由于磁性，非靶细胞会被外磁场吸收，而靶细胞则保留，从而实现分离。

阴性分选应用的优点：去除不需要的细胞；对于那些缺乏特异性抗体的细胞，例如肿瘤细胞。

该抗体仅靶向所有非靶向细胞，不刺激靶向细胞；负分拣始终是自定义分拣的一部分。

 4 磁珠分选的优点

磁珠分选活细胞的主要优点如下：纯度高、高效、容易操作、高回收率、成本低、一次性分离多种细胞、高细胞活率、可自动操作。

5 活细胞分选实操

5.1 具体步骤

（1）动物福利：在进行实验前，务必遵循动物福利。在动物麻醉后进行相关组织的采集，如果不伤及性命，务必做好拯救措施。（动物福利很重要，尤其是要发表SCI）

（2）组织消化：根据组织的特性选择合适的消化酶，然后将组织消化成细胞悬液，终止消化，使用2X双抗洗涤3次，每次五分钟，然后使用完全完全培养基制备细胞悬液。

表1 不同型胶原酶的适用组织

（3）一抗孵育：用少量DMEM充分重悬细胞(1×10⁸细胞/0.5ml)，加入一抗(10-20μg/ml终浓度，具体根据参考书而定)，4℃孵育30分钟（具体时间根据抗体说明而定，细胞不怕冷）。

（4）二抗孵育：用20倍体积DMEM洗涤细胞2-3次（可以将游离的一抗除去），再加入DMEM(1×10⁸细胞/0.3ml)充分重悬细胞后，加入相应二抗包被的超微磁珠，混匀后置8-15° C孵育10-15分钟（严格根据说明书操作，时间不要太长，不然一些非特意细胞会跟着沉淀下去，导致程度不高）。

（5）磁场分选：充分重悬细胞，放心移液器枪头尖的力量不足以把分子层面的结合打开，不过也吹撒出来，然后将分离柱安装入磁力架上，根据说明说，一般1-2min几个完成分离。

（6）消化除去磁珠：离心手机阳性细胞，然后使用使用0.25%胰蛋白酶消37℃化细胞1-3min，即可使磁珠和细胞分离，然后回收磁珠，将细胞使用完全培养基重悬，如果不放心，可以使用2x双抗洗涤细胞3次，每次5min。

（7）细胞铺板：对获得细胞进行计数，根据细胞的数量（总细胞*70%，因为极可能有死细胞）进行铺板。

表3 细胞培养皿规格与之对应的培养基和细胞量

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6 注意事项

（1）无菌操作：尤其分离细胞用作培养，全过程在超净台中完成；

（2）磁珠与细胞关系：超微磁珠及微小磁场系统适合于少量细胞分离(如10⁶-10⁷ cells)，使用前应当充分阅读说明书；

（3）柱分离：分离柱尾接上限速针头，收集的首次流下的细胞即为阴性选择细胞，一般纯度远远低于阳性选择，可直接丢弃，如果材料不珍贵/稀少；

（4）分离株使用次数：分离柱一般只能一次应用，再用时降低分离效率，不要因为省钱，导致实验结果不理想；

（5）含贴壁极强细胞：待分选细胞中如有贴壁细胞，建议在分选前先贴壁培养去除，或者提高EDTA浓度；

（6）分选前除去死细胞：抗体包被磁珠对死细胞常有非特异性结合，因而分选前去除死细胞（建议不是特别难养的细胞没必要清楚）；

（7）充分重悬细胞：上分离柱前，充分振荡，混悬细胞，打散细胞团块；

（8）孵育/磁场时间：孵育时间和温度应按说抗体明书进行，延长孵育时间、提高温度会增加非特异结合和阴性细胞沉底；

（爱自己！！！做科研!!! 每文格言“哲学家叔本华说：世界上最大的监狱，是人的思维意识。”如果有用，关注楼主GBhouse，点赞+讨论+欢迎有偿投稿，攻击型人格请请请不要关注和阅读！！！）