Phenomics | 类风湿关节炎风险基因ORMDL3及其表观遗传调控机制的发现

近日，《表型组学》（Phenomics）在线发表了复旦大学附属华山医院邹和建主任医师和朱载华副主任医师团队题为“A Common Functional Variant at the Enhancer of the Rheumatoid Arthritis Risk Gene ORMDL3 Regulates its Expression Through Allele-Specific JunD Binding”的研究论文。

本研究通过整合多个“组学”数据的综合基因组分析，发现潜在类风湿关节炎风险基因ORMDL3及其增强子调控区域，并通过体内外实验验证了该区域的rs56199421的T等位基因可以增强转录因子JunD与其结合，导致ORMDL3表达升高和类风湿关节炎发病的增加。

研究背景

全基因组关联研究（GWAS）极大地扩展了与类风湿关节炎（RA）相关的常见遗传位点。迄今为止，GWAS发现了100多个与RA风险相关的基因组位点。然而，在大多数情况下，功能受影响的基因和与其关联的潜在分子机制尚不清楚。本研究通过整合多“组学”数据的基因组分析，发现RA风险基因ORMDL3及其增强子区rs56199421（C[Ref]/T）调控位点的等位基因T可促进转录因子junD与其结合，从而导致ORMDL3的高表达，增加RA发生的风险，可能在RA的发病中起到重要作用。

研究结果

GWAS发现的大多数RA相关变异的功能尚不清楚。一种潜在的机制是基因组中的遗传变异可能影响转录因子的结合，导致风险基因的差异表达。为了验证这一假设，作者进行了多基因组分析：（1）与已发表GWAS NHGRI目录的52个RA相关的非MHC SNP存在强连锁不平衡（LD)（D'>0.8）；（2）影响靶基因表达的eQTL；（3）遗传变异直接影响转录因子的结合。分析已发表的ChIP-seq数据，作者发现转录因子JunD对免疫细胞功能和RA的发展可能至关重要。根据这三个标准，总共发现32个可能影响JunD结合的SNP，并可作为基因表达中起顺式作用的eQTL。

大多数已识别的SNP与其目标基因相距数千个碱基。其中rs56199421（C/T）与RA GWAS SNP rs2872507（D' = 0.87，1000 Genomes European ancestry [EUR]）完美LD。作为一种非编码变体，位于RA GWAS SNP rs2872507上游6,924个碱基对处。ORMDL3的TSS位于17号染色体上38.09Mb位置。这是一个开放且开放性染色质区域，该区域标有DNase I超敏位点（DHS）和高水平的H3K4me1活性组蛋白修饰（图1下）。有趣的是，已发表的Hi-C数据显示GM12878细胞系中rs56199421与ORMDL3启动子区域之间存在相互作用（图1上），表明含有rs56199421的区域可能通过与ORMDL3启动子相互作用作为增强子来调节ORMDL3的表达。

ChIP-seq数据显示，rs56199421的变异会影响转录因子JunD的结合，其中T等位基因表现出高亲和力。观察包含rs56199421的区域发现，除了与开放性染色质相关的表观遗传标记外，该区域还可能被其他转录因子占据，例如SP1（图1下）。由于许多转录因子同时作为蛋白质复合物调节基因表达，这些结果表明rs56199421的遗传变异可能影响转录因子的结合进而调节ORMDL3表达。经过以上生物信息学分析，本研究发现潜在RA风险基因ORMDL3的新调控区域。

图1 通过整合多“组学”数据的基因组分析发现类风湿关节炎风险基因及其潜在的增强子调控区域。

本研究通过评估RA患者中ORMDL3的表达来验证该风险基因。结果显示，与正常健康对照相比，RA患者PBMC中ORMDL3的mRNA水平显著高（RA与对照组：3.051 ± 0.549与1.984 ± 0.176（mean ± SEM）；p = 0.0353）（图2a）。此外，关节滑膜组织的免疫组织化学显示，与对照组的骨关节炎相比，RA患者中ORMDL3的蛋白水平也显著升高（图2b、2c）。这些数据显示ORMDL3的表达在RA患者中升高，表明其可能是RA的风险基因。

图2 RA患者的ORMDL3表达增加。

为了测试rs56199421的遗传变异是否可以直接影响JunD的结合，本研究进行了体外Pulldown实验。结果显示，纯化的转录因子JunD特异性地与含有rs56199421的DNA结合，并且与RA相关T风险等位基因的结合更强（图3b）。为了进一步探讨这种T等位基因依赖性的JunD结合是否会影响基因表达的转录活性，作者将包含RA风险T或非风险C等位基因的21bp的DNA序列克隆到无增强子的荧光素酶报告载体中，并测量293T细胞中的荧光素酶活性。结果显示，在JunD存在的情况下报告基因表达显著升高，并且rs56199421 T等位基因表现出比C等位基因更高的转录活性（图3c）。以上这些结果表明，转录因子JunD可以特异性结合含有rs56199421的ORMDL3增强子区域从而调节体外基因表达，rs56199421的T等位基因可以增强JunD的结合，导致基因表达进一步升高。

图3 增强子区rs56199421的T等位基因促进JunD的结合，导致基因的体外转录增加。

为了验证rs56199421的变异是否会影响体内ORMDL3的表达，本研究通过Sanger测序对来自RA和健康对照受试者PBMC基因组DNA进行rs56199421的多态性基因分型。结果表明，rs56199421的T等位基因与ORMDL3转录本的高表达显著相关（p = 3.25E-4）（图4a）。此外，rs56199421的T等位基因在RA患者中的比例较高（图4b）。总的来说，这些结果表明rs56199421的T等位基因可能是RA风险等位基因，导致ORMDL3表达升高。

图5 rs56199421（T）的RA风险等位基因与RA患者中ORMDL3表达增加有关。

研究结论

本研究表明，rs56199421的T等位基因可促进转录因子JunD的结合，从而增加增强子活性并促进RA风险基因ORMDL3的表达（图6）。

图6 增强子区rs56199421的T等位基因促进转录因子junD的结合， 增加ORMDL3 的表达导致类风湿关节炎的发病。

Abstract

Genome-wide association studies (GWASs) have identified more than 100 loci associated with rheumatoid arthritis (RA), but for most cases, the functionally affected genes and the underlying molecular mechanisms contributing to these associations are unknown. In this study, through an integrative genomic analysis incorporating multiple “omics” data, we identified a functional regulatory DNA variant, rs56199421, and its plausible mechanism regulating the expression of putative RA-risk gene, sphingolipid biosynthesis regulator 3 (ORMDL3). The T allele of rs56199421, located in the enhancer region of ORMDL3, exhibited stronger direct binding ability with the transcription factor, JunD, and higher transcriptional activity than the other C allele of rs56199421 did in vitro. Moreover, the T allele of rs56199421 is associated with elevated RA risk, as well as increased ORMDL3 expression in RA patients. Thus, these findings suggest the T allele of rs56199421 enhances its binding to the transcription factor, JunD, and thus leads towards increased the enhancer activity and elevated the expression of RA-risk gene ORMDL3.

通讯作者

邹和建

复旦大学附属华山医院主任医师、教授、博士研究生导师。华山医院党委书记，华山医院风湿科教授，博士研究生导师，学术带头人。复旦大学风湿、免疫、过敏性疾病研究中心主任。中华医学会风湿病学分会第七、第八届委员会副主任委员、上海市医学会风湿病专业委员会第八届主任委员、上海市医师协会风湿免疫科医师分会会长、中国医师协会风湿免疫科医师分会痛风专业委员会主任委员、硬皮病临床与研究国际协作网InSCAR副主席。主要从事痛风和高尿酸血症发病机制及干预策略的研究，系统性硬化（硬皮病）发病机制研究，以及皮肌炎、银屑病关节炎的临床研究等。近5年主持科技部973项目子课题、国家自然科学基金国际(地区)合作与交流项目，国家自然科学基金面上项目、上海市科委基础研究重大课题，近5年来以第一作者或通讯作者发表SCI研究论著50余篇，主编、副主编学术专著10余部。被评为上海市领军人才、上海市优秀学术带头人。其研究成果先后获得教育部高等学校科学研究优秀成果奖一等奖、教育部科学技术进步奖二等奖、上海市教学成果奖一等奖、上海市医学科技奖，二等奖等。

刘贇

复旦大学基础医学院生物化学与分子生物学系，研究员，博士生导师，上海市医学会医学遗传学专科分会委员，上海市生物信息学会理事。研究方向主要集中于复杂疾病的遗传、表观遗传调控机制及其临床转化研究。学术成果发表于 Nature Biotechnology、 Nature Genetics、Immunity、The American Journal of Human Genetics、Nucleic Acids Research等国际第一流的学术科研期刊上。在过去5年中，论文共被他引5000多次，所作出的学术成果受到包括纽约时报在内的多家主要媒体广泛报道。担任Nature Communications等杂志审稿人。

朱载华

复旦大学附属华山医院副主任医师，复旦大学博士，瑞典卡罗林斯卡医学院博士后，中国医院协会临床新技术应用专业委员会委员，上海市中医药学会数字化转型与诊疗技术分会委员。主要研究方向为痛风和类风湿关节炎的表观遗传学调控机制，主持国家自然科学基金项目一项，以第一作者或通讯作者发表SCI论文9篇。 

第一作者

叶文静 

复旦大学附属华山医院主治医师，复旦大学博士。主要研究方向为自身免疫性疾病如类风湿性关节炎、系统性硬化症的发病机制及治疗。以第一作者分别在Phenomics、Laboratory Investigation、Immunological Investigations、BMC Neuroscience、Rheumatology and Immunology Research、中华风湿病学发表文章各1篇。主持浦江PROG基金1项。