蛋白质免疫印迹（Western Blot，WB）实验步骤详解及常见问题分析

1、概述

蛋白质免疫印迹（Western Blot，WB）是一种基于抗体技术的经典蛋白质分析方法，常用于鉴定某种蛋白，并能对该蛋白进行定性和半定量分析，在分子生物学、生物化学、免疫遗传学等方面有着广泛的应用。

WB实验的核心是抗原抗体的特异性结合。通过SDS聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳将不同分子量的蛋白质分离开，然后转移到适合的膜上，再用目标特异性抗体检测目标蛋白，加入对应的二抗（如：HRP标记的二抗）后，形成蛋白/一抗/二抗复合物，加入化学发光液后，在目的蛋白位置就会产生荧光。最后用胶片或化学发光仪就可以检测记录目标蛋白的条带信息，与已知标准或对照比较即可评估目标蛋白的大小和浓度。

WB常规实验流程

2、实验步骤详解

WB实验采用SDS-PAGE凝胶，在外电场作用下，较小蛋白质的泳动速度较快，而较大蛋白质的泳动速度较慢，从而将不同分子量的蛋白质分离开，其中SDS在水溶液中带有负电荷，可以将蛋白质变性并覆盖在蛋白质表面，从而消除了蛋白质本身所带电荷的影响，使蛋白质在电场中的电泳速度仅与蛋白质的大小有关。

表1：SDS-PAGE有效分离范围

2.1 蛋白样品的制备

1、标准曲线的绘制：取一块酶标板，按下表体积加入相应试剂

根据样品数量，将BCA试剂A与B按体积比为50:1配制适量的BCA工作液，充分混匀并现配现用，酶标板各孔再加入200 μl的BCA工作液，37℃孵育30 min，记录其在562 nm下的吸光度，以蛋白含量为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。

2、待测样品的浓度测试：将待测样品稀释到合适的浓度（18 μl ddH2O+2μl 待测蛋白样品，对照组直接取20 μl ddH2O），取稀释后的样品20 μl，再加入200 μl的BCA工作液，37℃孵育30 min，记录其在562 nm下的吸光度，根据标准曲线，计算出相应蛋白的含量。

3、均一化蛋白样品浓度：经BCA法测定蛋白浓度后，将各个蛋白样品浓度均一化，并与对应四分之一体积的5 × loading buffer上样裂解缓冲液混匀，95 ℃煮沸5 min，冷却离心备用（可放置于-80℃冰箱保存）。

2.3 SDS-PAGE电泳

1、清洗玻璃板：用洗洁精洗，冲洗干净，再用蒸馏水冲洗干净，然后放在烘箱中烘干；

2、灌胶：玻璃板对齐后放入夹中卡紧，然后垂直卡在架子上，准备灌胶；

3、配分离胶：先配分离胶（分离胶的浓度根据目标蛋白的分子量确定，可参照本文表1），加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。

4、水封：灌完胶后，胶上加水液封（要慢），左右轻轻摇一下架子，使分离胶顶端更平整；当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干；

5、配浓缩胶：配4%的浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶，将剩余空间灌满浓缩胶，然后将梳子插入浓缩胶中；

6、拔梳：待到浓缩胶凝固后（约20-30min），两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出；

7、组装：将玻璃板从夹子上取下，放在电泳槽上（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外），另一边放另一块玻璃板，也是小玻璃板面向内，大玻璃板面向外（若只跑一块胶，另一边要垫一块塑料板将有字的一面朝外），两块玻璃板都放好后夹紧，放入电泳槽中；

8、检漏：向内槽中加入水检测是否漏液，如果不漏，再向内外槽中加电泳缓冲液；如果漏，重新把玻璃板插好，使内外槽不连通；

9、点样：蛋白marker：2~3 μl左右即可；待测试样品一般：细胞裂解液20-30 μg，纯蛋白1 μg左右；为防止跑偏，在点样的另一端可加loading buffer。

10、电泳：电泳时推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳（80-100 V），在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳（120 V左右）。根据目标条带位置及所用的电压控制电泳时间，一般为90－120 min，设置定时可避免电泳过头。

11、取下胶：取下电泳后的凝胶，暂存与转膜buffer里。

2.4 转膜

2.4.1原理

蛋白质经SDS-PAGE分离后，必须及时从凝胶中转移到固相支持物上，固相支持物能牢固结合蛋白又不影响其抗原活性，这使其比直接在凝胶上检测更易操作。蛋白质从凝胶向膜转移的过程常采用电转印法包括湿转和半干转，与SDS结合的蛋白带有负电，在电场中向正极迁移，并最终结合在固相支持物上。

常用的WB转移膜主要是硝酸纤维素（Nitrocellulose, NC）膜和聚偏二氟乙烯 （Polyvinylidene Fluoride, PVDF）膜。NC膜：NC与蛋白质靠疏水作用结合，无需预先活化，对蛋白质的活性影响小，但结合在NC上的小分子蛋白质在洗涤时易丢失且NC韧性较差，易损坏。PVDF膜：与蛋白质亲和力高，用前需在甲醇中浸泡，以活化膜上的正电基团，使其更容易与带负电荷蛋白结合。

湿转耗费转膜液较多，操作相对复杂，但不容易出错，主要用于转印大分子量蛋白质；而半干转主要用于转印小分子量蛋白质（超过100 kDa的建议湿转）。

2.4.2湿转：

1、将胶浸于转膜缓冲液中平衡10 min。 如目标蛋白分子量较小，不用平衡，因小分子蛋白容易扩散出胶； 

2、取适量转膜液于盘中，然后在盘中依次垫好海绵、滤纸、膜（PVDF膜需用纯甲醇浸泡2 min左右）、胶、滤纸、海绵，每次放好后，用尺子赶去气泡；

3、将上述三明治放在夹板上，胶一侧对黑色面，膜一侧对白色面，夹好夹板，然后将夹板放入转移槽中（黑色面对黑色面）；

4、加转膜液（转膜液可预先冷藏降温），在一侧放两个冰袋，然后置于冰浴中，插上电极，恒流250 mA，2 h；

5、转膜结束后，切断电源，取出杂交膜。

2.4.3半干转：

1、半干转，三明治在转膜过程中并没有浸没在转膜液中，在转膜之前需用相应的电转液浸泡滤纸、膜、胶一定时间（充分浸透滤纸即可），PVDF膜需要在甲醇中活化 2 min。

2、半干转转膜效率高，转膜条件20 V-25 V，35 min。因转膜液用量少，一般不回收转膜液，用新配制的。

2.5. 免疫反应

   2.5.1原理

抗体杂交之前，防止免疫试剂的非特异性吸附，需采用异源性蛋白质先对转印膜进行封闭，从而降低背景。常用封闭物有5%脱脂奶粉和BSA。

封闭后，目标蛋白与特异性的一抗进行免疫反应，一抗可以是标记的，也可以是非标记的。标记的一抗与免疫原结合后，可直接进行检测，降低了背景和非特异性结合，但信号较弱。非标记的一抗配合标记的二抗使用，对信号有级联放大作用，常用的酶包括碱性磷酸酶（AP）和辣根过氧化物酶（HRP），通过与底物反应产生光信号，可以增加灵敏性。

2.5.2步骤：

1、封闭：打开夹子，取出膜，放在5%的脱脂牛奶中，室温下脱色摇床上摇动封闭2小时（2-3 h），封闭时速度要慢；

2、一抗：取出封闭的膜，用TBST漂洗3次，每次5分钟，漂洗结束后，剪下目标蛋白及内参蛋白区域的膜，置于预先配制好的一抗稀释液，保证蛋白面向上并完全浸润，置于4°C缓慢摇晃过夜。

3、洗膜：次日取出膜，用TBST缓冲液洗涤3次，每次5 min。

4、二抗：漂洗结束后，将膜置入用5%脱脂牛奶稀释好的二抗中，室温缓慢摇荡1~2 h，TBST缓冲液洗涤3次，每次5 min。

3. 化学发光

根据ECL Western Blotting发光显影试剂盒的使用说明，在棕色的离心管中按比例配制，将液体均匀置于膜上用曝光机拍照，分析灰度。也可用DAB 显色试剂盒子进行显影分析

4、实验结果分析

WB实验的核心是抗原抗体的特异性结合。所以形成蛋白/一抗/二抗复合物过程中用到的一抗二抗对实验的成功至关重要， 康体生命致力于纳米抗体VHH的研发定制，较传统的抗体，纳米抗体具有高亲合力、高特异性、强组织穿透性和易于改造和表达等特点；由于纳米抗体微小的结构，具有良好的水溶性，以及较低的免疫原性。用康体生命自行研发设计的纳米抗体（如：Flag-Tag VHH）做WB，背景干净，特异性好，能在复杂的蛋白体系中与目标蛋白特异性结合。

Whole cell lysates ：表达flag标签蛋白的全细胞裂解液(lane 1)

Purified protein ：带Flag标签的纯蛋白(lane 2)

 用 Flag-Tag VHH抗体与目标抗原特异性结合

5、常见问题分析