真核生物组织/体细胞与精子中DNA的提取-全方位知识囊括及实验操作

1 背景知识介绍

1.1 生物体DNA

生物体中的DNA：脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid, DNA)是存在于生物体每个细胞中的物质，它持有个体的遗传密码。DNA的碱基序列是物体用来编写生遗传信息的指令代码。四种化学碱基组成DNA编码语言，包括: 腺嘌呤（Adenine, A）、胞嘧啶（Cytosine, C）、胸腺嘧啶（Thymine）和鸟嘌呤（Guanine, G）,通过A与T，C与G进行配对，形成双链。就是如此简单的碱基因序列排列组合的不同，在调控基础之上能够编码出生数以万计的功能性蛋白。据估计，人体中约有30亿对碱基，大约99%的这些碱基在每个人身上都是一样的，剩下的1%让呈现个体特异性。

1.2 DNA和包装蛋白储存遗传信息

人类有23对染色体(总共46条)，染色体分为22对常染色体和一对性染色体(X和Y)。个体从父母双方各得到一半的染色体，配对形成一对一对的染色体。染色体的总长度为 200 nm（1 nm = 10^{− 9} m）;如果染色体被解开，它们所包含的遗传物质的长度约为2米（约6.5英尺）。DNA通过蛋白的作用凝聚在染色体中，实现遗传物质的储存。

（图1 人类染色体示意图。 22对常染色体和1对性染色体（控制性别））

1.2.1 体细胞DNA组蛋白包装

染色体的基本构成单位是核小体（Nucleosome），核小体是包裹在染色质中的基本重复亚基。单个核小体由大约150个碱基对的DNA序列组成，这些DNA序列包裹在组蛋白的核心上。在形成染色体的过程中，核小体反复折叠自身以收紧和浓缩包装好的DNA。每个核小体都包含一个核小体核心，由组成核心组蛋白八聚体复合物（H2A,H2B,H3,H4各两个拷贝）形成一个包裹145至147bp DNA的线轴。核小体核心相连 通过一段接头DNA到相邻的核小体核心，该通常与接头组蛋白（H1 或 H5）相关。核小体具有 ∼165 bp DNA 的核心以及接头组蛋白是称为染色体。因此，体细胞的染色体主要是由核小体中的DNA和组蛋白，缠绕在一起，经过高浓度的形成 [1]。

（图2 体细胞核小体结构示意图）

1.2.2 精子DNA以及蛋白组装

精子中DNA和组装蛋白不是组蛋白，就不得不提精子发生。精子发生是雄性配子产生的过程，具有连续的细胞分化，可细分为精原有丝分裂、精母细胞减数分裂和精子发生。在精子发生过程中，SSC（精原干细胞）经历自我更新并分化为精原细胞，精原细胞进行减数分裂以产生单倍体生殖细胞并通过减数分裂重组确保遗传多样性。在精子发生（Spermiogenesis）中的核染色质重组过程中，大多数体细胞组蛋白首先被睾丸特异性组蛋白变体取代，随后过渡蛋白（transition proteins, TPs）掺入精子细胞的细胞核中，鱼精蛋白（protamines, PRMs）进一步取代晚期精子细胞中的TPs，将基因组包装到高度浓缩的精子核中。在组蛋白向鱼精蛋白的转化过程中，组蛋白变体和特异性组蛋白修饰通过调节染色质压缩和高级染色质结构。组蛋白替代或修饰的缺陷可能导致无精子症、少精子症或畸精子症，从而导致男性不育。因此，精子中涉及遗传信息组装压缩的蛋白是鱼精蛋白（>95%），而不是组蛋白（<5%）。

根据1.2.1 和 1.2.2 的描述，可知体细胞DNA和精子DNA压缩过程中的蛋白是不一样的，前者是组蛋白，后者主要是鱼精蛋白。因此，在提取体细胞和精子的DNA使用的方法不一样 [2-4]。

（图3 精子核小体中组蛋白倍鱼精蛋白取代示意图）

1.3 DNA从染色体释放出来的关键酶

蛋白酶K（Proteinase K）是由真菌Tritirachium album Limber产生的，是一种内溶性蛋白酶，可在脂肪、芳香或疏水氨基酸的羧基侧切割肽键。蛋白酶K被归类为丝氨酸蛋白酶。提取缓冲液中的蛋白酶K使核酸酶失活，并有助于上皮细胞和白细胞的裂解以释放核DNA。核酸酶失活是DNA分离的重要步骤 [5-6]。

（图4 蛋白酶K消化蛋白扮演的消化角色）

二硫苏糖醇(Dithiothreitol, DTT)将二硫化物还原为二硫醇，允许DNA从其保护蛋白中释放出来，并通过蛋白酶k进一步降解蛋白质 [7]。由于细胞膜含有高浓度的二硫化物，DTT是精子细胞裂解的重要成分,一种专门减少精子蛋白二硫键的化学物质，是精子鱼精蛋白解离二硫键的关键化学物质，以前已被用于促进牛ICSI卵母细胞中精子染色质的去浓缩 [8]，提高猪卵母细胞发育能力 [9]。

2 真核生体细胞DNA提取实操

体细胞（somatic cell）是相对于生殖细胞的概念，其遗传信息不会像生殖细胞那样遗传给下一代。高等生物除了精子和卵细胞以及它们的母细胞之外，其它细胞可以统称为体细胞。

（图5 DNA提取流程示意图）

2.1 氯仿-苯酚提取体细胞DNA

（1）细胞(10cm皿)+ 8mlTE(Tris-EDTA抑制酶活性，降低细胞膜稳定性) ；

（2）加入800μL 10%的SDS(裂解细胞与抑制核酸酶、退化蛋白)完全混合(SDS最终浓度0.5-1%)；

（3）将蛋白酶K(10mg/ml)加入细胞混合液中，使其最终浓度为50-100 μg/ml，分配1ml至1.5/2ml管中；

（4）将试管放入55℃的水浴釜中浸泡4小时(组织需要过夜)；

（5）加入平衡苯酚(PH=8，保持DNA稳定，苯酚使蛋白质变性，抑制NDA酶，氧化苯酚会破坏DNA)，10-30分钟混合均匀或放入摇床；

（6）将上清液收集到新管中，用7500×g离心15分钟；

（7）加入苯酚/氯仿(1:1)后，用7500×g离心机离心15分钟，将800 μL上清液转移到新管中；

（8）加入10%体积的10 M醋酸盐(铵)辅助DNA沉淀；

（9）加入2倍体积的异丙醇或乙醇(将异丙醇或乙醇放入-20℃冰箱中)；

（10）7500×g浸泡15分钟，吸弃上清液；

（11）加入1ml 75%酒精(盐水离子)，用7500×g洗涤5分钟，然后吸弃上清；

（12）将试管放入60℃培养箱中10-15分钟，使酒精蒸发；

（13）用200μL TE溶解DNA(如果能看到沉淀物应加200μL TE，看不到沉淀物应加100μL TE)；

（14）采用紫外分光计检测DNA的浓度和纯度。注意：D260/D280= 1.8（纯）；＞1.8           RNA残留；＜1.8 蛋白污染。

2.2 氯仿-苯酚提取精子DNA提取

（1）细胞(10cm皿)+ 8mlTE(Tris-EDTA抑制酶活性，降低细胞膜稳定性) ；

（2）加入800μL 10%的SDS(裂解细胞与抑制核酸酶、退化蛋白)完全混合(SDS最终浓度0.5-1%)；

（3）加入2mM 二硫苏糖醇(DTT)预处理精子20分钟，在37℃；

（4）将蛋白酶K(10mg/ml)加入细胞混合液中，使其最终浓度为50-100 μg/ml，分配1ml至1.5/2ml管中；

（5）将试管放入55℃的水浴釜中浸泡4小时(组织需要过夜)；

（6）加入平衡苯酚(PH=8，保持DNA稳定，苯酚使蛋白质变性，抑制NDA酶，氧化苯酚会破坏DNA)，10-30分钟混合均匀或放入摇床；

（7）将上清液收集到新管中，用7500×g离心15分钟；

（8）加入苯酚/氯仿(1:1)后，用7500×g离心机离心15分钟，将800 μL上清液转移到新管中；

（9）加入10%体积的10 M醋酸盐(铵)辅助DNA沉淀；

（10）加入2倍体积的异丙醇或乙醇(将异丙醇或乙醇放入-20℃冰箱中)；

（11）7500×g浸泡15分钟，吸弃上清液；

（12）加入1ml 75%酒精(盐水离子)，用7500×g洗涤5分钟，然后吸弃上清；

（13）将试管放入60℃培养箱中10-15分钟，使酒精蒸发；

（14）用200μL TE溶解DNA(如果能看到沉淀物应加200μL TE，看不到沉淀物应加100μL TE)；

（15）采用紫外分光计检测DNA的浓度和纯度。注意：D260/D280= 1.8（纯）；＞1.8           RNA残留； ＜1.8 蛋白污染。

（总体来将精子DNA的提取在蛋白酶K使用前使用二硫苏糖醇进行预处理）

Table 1 提取细胞/组织DNA裂解液配制(提DNA万能缓冲液)

（爱自己！！！做科研!!! 每文格言杨绛，中国作家，翻译家，外国文学研究家“无论什么关系，情分被消耗殆尽，缘分便是到了终点。把错归咎于自己，并且礼貌的退场，把自己还给自己，把他人还给他人。让花成花，让树成树。从此山水一程，再不相逢，愿来生，不见，不欠，不念。”如果有用，关注楼主GBhouse，点赞+讨论，攻击性人格请请请不要关注和阅读！！！）

参考：

 [6] In the human sperm nucleus, nucleosomes form spatially restricted domains consistent with programmed nucleosome positioning

[7] In the human sperm nucleus, nucleosomes form spatially restricted domains consistent with programmed nucleosome positioning

[8] Transcriptome analysis of highly purified mouse spermatogenic cell populations: gene expression signatures switch from meiotic-to postmeiotic-related processes at pachytene stage

[9] Staged developmental mapping and X chromosome transcriptional dynamics during mouse spermatogenesis

[5] NaOH treatment to neutralize inhibitors of Taq polymerase

[6] The modified method of two-step differential extraction of sperm and vaginal epithelial cell DNA from vaginal fluid mixed with semen

[7] Sperm Pretreatment with Dithiothreitol Increases Male Pronucleus Formation Rates After Intracytoplasmic Sperm Injection (ICSI) in Swamp Buffalo Oocytes

[8] Intracytoplasmic sperm injection in bovine: effects of oocyte activation, sperm pretreatment and injection technique

[9] Effects of dithiothreitol and boar on pronuclear formation and embryonic development following intracytoplasmic sperm injection in pigs