求助| pET-28a和目的基因连接不上

我是用EcoRI和saLI将表达载体pET28a和pT-基因提质粒后，同时进行双酶切，用的20ul体系，放在金属浴中第一次做是37℃ 30 分钟，第二次是37℃ 45分钟，因为我用的是快切酶，说明书上是5-15分钟，但是我怕切不开，就延长了一会儿，酶切后进行跑胶胶回收，胶回收的浓度非常低，一次是只有个位数，还有一次是pet是个位数，但是基因是几十，大概35这样，两次都接着往后做了，用t4连接酶在16℃下过夜连接了，体系也都是20微升，除去2微升的buffer，1微的t4连接酶，其他加的都是载体和目的基因，由于浓度低，连接了好几管，有的按照一半载体一半基因加的，也有载体少加点，基因多加点的，然后第二天热激转化到Dh5a中，摇菌涂板，长的菌落非常少，进行挑单pcr验证，发现没有目的条带，已经做了好几次了，还是不知道原因出现在哪里，唯一一次有目的条带的那次，条带非常浅，并且送了测序后只有空载体的序列，没有我的目的基因序列

前面两个是pET-28a后面两个是pT-基因进行双酶切后的