Immunity | 研究揭示焦亡细胞线粒体损伤新机制

Gasdermin D（GSDMD）激活的炎症细胞死亡（焦亡）会导致线粒体损伤，但其基本机制和功能后果在很大程度上尚属未知。在这里，我们发现 N 端形成孔隙的 GSDMD 片段（GSDMD-NT）会迅速损伤线粒体内膜和外膜（OMMs），导致线粒体数量减少、有丝分裂、ROS、跨膜电位丧失、氧化磷酸化（OXPHOS）减弱以及线粒体蛋白和 DNA 从基质和膜间隙中释放出来。在质膜损伤之前，一旦 GSDMD 被裂解，线粒体损伤就会发生。线粒体损伤与 B 细胞淋巴瘤 2 家族无关，取决于 GSDMD-NT 与心磷脂的结合。通过基因消减心磷脂合成酶（Crls1）或将心磷脂转移到 OMM 的扰乱酶（Plscr3），可抑制线粒体损伤、焦亡和炎性细胞因子释放的典型和非典型炎性体激活。肿瘤中磷脂扰乱酶-3（PLSCR3）的缺乏损害了焦亡触发的抗肿瘤免疫。因此，线粒体损伤在焦亡中起着关键作用。

 前言 

  当免疫细胞和屏障上皮感知到入侵病原体和危险信号时，它们会组装细胞膜模式识别受体，即炎症体，从而招募并激活炎症性 caspase（caspase-1、-4、-5 和 -11）。Caspase-1 由典型炎症体-核苷酸寡聚化结构域（NOD）样受体、吡喃蛋白和黑色素瘤 2（AIM2）样受体激活。来自侵入性革兰氏阴性细菌的细胞膜脂多糖（LPS）和内源性氧化磷脂结合并激活人的 caspase-4 和 -5 以及小鼠的 caspase-11，从而组装成非正则炎症小体。蛋白酶裂解会从自动抑制的 C 末端释放出一个 N 末端（NT）孔形成片段。N 端形成孔隙的 GSDMD 片段（GSDMD-NT）与质膜内侧小叶上的酸性磷脂结合并寡聚形成膜孔，从而破坏细胞膜并释放炎性细胞因子和细胞警戒素，包括白细胞介素-1（IL-1）家族细胞因子。

  线粒体是控制细胞命运和免疫反应的中心枢纽。在细胞凋亡过程中，线粒体外膜（OMM）通过激活促凋亡的 bcl-2 家族成员 bcl-2-associated x 蛋白（BAX）和 bcl-2-antagonist/killer （BAK）而发生渗透，将包括细胞色素 c 在内的致凋亡因子从线粒体膜间隙（IMS）释放到细胞膜上。线粒体外膜通透（MOMP）会引发凋亡小体的形成，从而激活 caspase-9 裂解并激活 caspase-3，为扩大细胞死亡（被称为 "不归点 "）提供了一个强有力的前馈机制。在细胞凋亡后期，线粒体通透性转换（mPT）会破坏线粒体内膜，导致线粒体持续去极化。线粒体活性氧（ROS）和跨膜电位的丧失也会由不依赖于 Caspase 的程序性细胞死亡产生，包括粒酶介导的杀伤、坏死性凋亡和铁死亡，它们大多不会引发 MOMP。

   线粒体 ROS、跨膜电位丧失、细胞色素 c 和线粒体 DNA（mtDNA）释放到细胞膜的情况以前已有描述。虽然线粒体 ROS 有助于焦亡，但其作用是否关键尚不清楚。此外，焦亡线粒体损伤的机制及其对细胞死亡的影响程度也不清楚。

  形成气孔的第一步是 GSDM-NT 与酸性磷脂结合。与质膜酸性磷脂相比，GSDM-NT 与线粒体膜和细菌膜上的心磷脂结合力更强。心磷脂由基质中的心磷脂合成酶 1（CRLS1）合成，并可通过磷脂扰乱酶-3（PLSCR3）从 IMM 内小叶翻转到 IMM 外小叶，再从 IMM 外小叶翻转到 OMM 的两个小叶。诱导线粒体 ROS 和/或跨膜电位丧失的线粒体毒素会导致心磷脂转移到 OMM，并在那里锚定 GSDM-NT 结合。

  在这里，作者发现 GSDMD-NT 触发了线粒体细胞死亡途径。在焦亡早期，GSDMD-NT 会破坏两层线粒体膜，在质膜通透之前导致线粒体损伤。焦亡过程中的线粒体损伤取决于 OMM 心肌磷脂，因为 Crls1 或 Plscr3 的基因消减几乎会使线粒体损伤消失。它的发生与 BAX、BAK 和线粒体通透性转换孔（mPTP）无关。它破坏线粒体形态和呼吸，诱导有丝分裂，减少线粒体数量。线粒体损伤取决于 GSDMD 对线粒体两层膜的渗透作用，释放出 IMS 和基质的内容物，包括 mtDNA。IMS 外显子核酸酶 PNPT1 的释放会导致全局 mRNA 的衰减，从而加强焦亡，这在之前的细胞凋亡中已有描述 。此外，线粒体损伤对于焦亡细胞和炎症至关重要。

 实验结果1 

线粒体在焦亡过程中受损

  为了剖析线粒体在焦亡中的作用，作者用线粒体跨膜电位敏感的线粒体追踪深红（MTDR）和不敏感的线粒体追踪绿（MTG）以及电位染料四甲基罗丹明甲酯（TMRM）对经 LPS+ nigericin 处理的 THP-1 细胞进行了线粒体完整性和膜电位评估（图 1A 和 1B）。与相邻的 SYTOX 或 PI 阴性活细胞相比，SYTOX 或碘化丙啶（PI）阳性焦亡细胞中 MTDR 和 TMRM 荧光明显减弱，而 MTG 染色持续存在，表明线粒体在焦亡过程中去极化。测量了细胞外酸化率（ECAR）和耗氧量（OCR），以分别评估线粒体代谢中的糖酵解和氧消耗。由于 LPS 引物本身会将代谢从 OXPHOS 转移到糖酵解，如先前所报道的那样 ，因此在不使用 LPS 的情况下使用 nigericin 刺激焦亡。nigericin 本身可迅速增加 ECAR 并抑制线粒体呼吸，表明焦亡过程中线粒体 OXPHOS 功能减弱。对加入 nigericin 引发焦亡前后的 LPS 激发的 THP-1 细胞进行透射电镜观察（TEM），发现线粒体形态发生了变化--加入 nigericin 前，线粒体是典型的卵圆形、双膜结合的囊泡，内部有嵴，但加入 nigericin 后，线粒体缩小变圆，平均长度减少了∼2 倍（图 1C 和 1D）。加入 nigericin 后 15 分钟内观察到含有受损线粒体的自噬体。1 小时后，60% 的线粒体出现嵴旋转或缺失和/或 IMM 和 OMM 断裂，线粒体数量减少了 2 倍。因此，线粒体在引发焦亡后的早期就受到了严重破坏。

  为了评估 GSDMD 孔在线粒体损伤中的作用和动力学，用免疫印迹法分析了经 nigericin 处理的 THP-1 培养液及线粒体和细胞膜部分的 caspase-1、GSDMD 和 pro-IL-1β 裂解、GSDMD-NT 与线粒体的结合以及细胞膜释放和分泌的线粒体内容物（IMS 细胞色素 c、基质 ACO2 和 mtDNA）（图 1E-1G）。线粒体部分不含可检测到的核（Lamin B1）、溶酶体（LAMP1）、内体（EEA1）或内质网（calnexin）标记物。Caspase-1、GSDMD 和 IL-1β 在 7.5 分钟内被裂解。在 7.5 分钟时，线粒体部分也检测到了 GSDMD-NT，但未检测到全长 GSDMD（GSDMD-FL），这表明 GSDMD-NT 在生成后不久就与线粒体结合。在加入 nigericin 后的 7.5 分钟和 15 分钟内，在细胞液中检测到了 mtDNA 和可溶性细胞色素 c 和 ACO2，但未检测到 IMM 相关的 COX IV，这表明两种线粒体膜都被迅速破坏，这与 GSDMD-NT 孔的快速形成是一致的。相比之下，直到加入 nigericin 30 分钟后，才在培养上清液中检测到 IL-1β、细胞色素 c 和 ACO2，表明质膜通透性延迟。这些数据表明，GSDMD-NT 可在质膜之前使 OMM 和 IMM 通透。由于细胞膜 mtDNA 可激活 AIM2 炎症小体以扩大焦亡，因此在 LPS+ nigericin 或 LPS 转染（不直接激活 AIM2）或 poly（dA:dT）转染直接激活 AIM2 后，检测了永生化小鼠骨髓源性巨噬细胞（iBMDMs）中 AIM2斑点的形成。在 poly(dA:dT) 和 LPS 转染的 iBMDMs 中同样检测到了 AIM2斑点，这表明 mtDNA 的释放二次激活了 AIM2。在经 LPS+ nigericin 处理的细胞中未检测到 AIM2斑点，这可能是因为与凋亡相关的含 CARD 的斑点样蛋白（ASC）可能已被 NLRP3 招募而耗竭。

 实验结果2 

线粒体功能障碍发生在焦亡早期，是焦亡所必需的

  平板阅读器还评估了经 LPS+ nigericin 处理的 THP-1 的线粒体膜电位（TMRM 强度）、细胞 ROS 生成（DCFDA 强度）和质膜通透性（SYTOX 绿吸收）（图 2A）。在细胞吸收 SYTOX 绿之前，DCFDA 上升，TMRM 下降，证实线粒体功能障碍先于细胞死亡。MitoSOX（线粒体 ROS）、DiIC1（线粒体膜电位）和 SYTOX 绿吸收的流式细胞术证实了这一点（图 2B）。在 SYTOX 绿吸收前 10 分钟检测到 MitoSOX 和 DiIC1的显著变化。

  为了测试线粒体损伤在焦亡中的重要性，用溴化乙锭（EB）处理 iBMDMs，生成线粒体缺失的 ρ° 细胞（图 2C）。EB 未处理和处理过的 iBMDMs 在 LPS 引物作用后同样上调了促炎细胞因子（IL-1β、IL-6 和 TNF-α）、NLRP3、ASC 和促 Caspase-11 的表达，在 LPS+ nigericin 作用后同样激活了 Caspase-1 和 GSDMD 的裂解。然而，通过 CellTiter-Glo 检测，ρ° iBMDMs 对典范（LPS+nigericin）和非典范（转染 LPS）炎酶体介导的焦亡均有很强的抵抗力（图 2D 和 2E），这表明线粒体在焦亡细胞中起着关键作用。

  接下来，作者用 MitoTEMPO 清除线粒体 ROS，研究线粒体 ROS 是否有助于 iBMDMs 的焦亡。在经MitoTEMPO处理的iBMDMs中，LPS+nigericin或LPS或dA:dT转染诱导的SYTOX Green摄取和乳酸脱氢酶（LDH）释放被减弱（图2F-2I），尽管Nigericin诱导的caspase-1和GSDMD裂解不受MitoTEMPO的影响。为了证实 ROS 在焦亡中的作用，作者使用了一个化学遗传系统，通过表达酵母 D-氨基酸氧化酶（DAAO）（可将 D-氨基酸（而非内源性 L-氨基酸）转化为α-酮酸以产生 H2O2），标记核输出或定位序列40 和对 H2O2 敏感的比率计荧光生物传感器 HyPer741（图 2J-2L），对细胞内的氧化还原状态进行局部操纵。向表达细胞质 HyPer7-DAAO 的细胞中添加 D-丙氨酸（而不是 L-丙氨酸）会增加细胞质 H2O2 和焦亡。相反，在表达核 HyPer7-DAAO 的 iBMDM 中，D-丙氨酸不会增强焦亡。因此，正如之前所描述的，细胞膜 ROS 会放大规范和非规范炎性体介导的焦亡。

 实验结果3 

GSDMD-NT 在质膜破坏之前转运到线粒体并对其造成破坏

  为了在活细胞中确定 GSDMD-NT 是否与线粒体结合并介导线粒体功能障碍，作者对表达多西环素（DOX）诱导型 I105N GSDMD-NT 的 iBMDM 进行了成像，其 C 端与蓝色荧光蛋白（GSDMD-NT-BFP）融合。加入 DOX 6 小时后，活细胞共聚焦成像技术开始跟踪 GSDMD-NT 定位、质膜通透性（PI 或 SYTOX 摄取）和线粒体损伤（MitoTracker、TMRM 和 MitoSOX）的动态变化（图 3A、3B）。每个细胞在首次检测到染料吸收（质膜损伤）时定义时间 0，从而同步进行猝灭变化。经 DOX 处理后，表达 GSDMD-NT-BFP 的细胞中 MitoTracker 和 TMRM 强度均下降，最终死亡，以 PI 或 SYTOX 摄取量评估（图 3A 和 3B），而表达 FL-GSDMD-BFP 的细胞中线粒体染料强度和 PI 摄取量无变化。GSDMD-NT-BFP 至少在质膜通透前 50 分钟与线粒体染料定位（图 3A 和 3B），证实了 GSDMD-NT 早期靶向线粒体。在 PI 或 SYTOX 吸收之前，MitoTracker 和 TMRM 强度逐渐降低，而 MitoSOX 信号增加。所有线粒体标记最终消失，表明线粒体溶解。如前所述，在焦亡后期质膜通透后，从受损线粒体释放的 MitoSOX Red 染色了细胞核。

  经 LPS+ nigericin 处理的 THP-1 早期也会出现线粒体 ROS 和跨膜电位丧失，但细胞死亡发生得比异位表达 GSDMD-NT-BFP 更快。因此，GSDMD-NT 线粒体结合和功能障碍先于质膜通透。为了证实 GSDMD-NT 与线粒体的共定位，作者在 HEK293T 中表达了 FLAG 标记的 GSDMD-FL 或 -NT。转染 18 h 后，当表达 GSDMD-NT 的细胞中有 30% 死亡时，通过共聚焦显微镜（图 3C）、结构照明显微镜（SIM）（图 3D）和免疫-EM（图 3E）分析了 GSDMD-FL 和 GSDMD-NT 的定位。在荧光显微镜图像中，异位的GSDMD-NT（而非GSDMD-FL）在很大程度上与线粒体共聚焦并在线粒体上形成点状（图3C和3D）。同样，在免疫-EM 中，只有在转染 GSDMD-NT 表达细胞 18 小时后，线粒体中才会富集抗FLAG 连接的金颗粒（图 3E）。在这一早期阶段，很少在质膜上检测到金颗粒，这证实了 GSDMD-NT 先于质膜进入线粒体（图 S2I）。

  为了证实 GSDMD 在线粒体损伤中的重要性，比较了 LPS+igericin 处理的野生型（WT）和 Gsdmd-/- iBMDMs 中的 MTDR 和 TMRM、染料吸收、线粒体超微结构以及线粒体释放的细胞色素 c、ACO2 和 mtDNA（图 S3A-S3F）。与 WT iBMDMs 相比，Gsdmd-/- iBMDMs 添加 nigericin 后线粒体得以保留，这表明 GSDMD 参与了线粒体的焦亡。与 GSDMD 在线粒体损伤中的直接作用相一致的是，NLRP3 抑制剂 MCC950 无法抑制 LPS 或 poly(dA:dT) 转染造成的线粒体损伤。

 实验结果4 

焦亡线粒体损伤与 BAX、BAK 和 mPTP 无关

  在细胞凋亡过程中，促凋亡的 BCL-2 家族蛋白（BAX 和 BAK）形成 OMM 孔，导致 MOMP，但使 IMM 保持完整。为确定 BAX 或 BAK 是否参与焦亡，比较了表达 GSDMD-FL 或 GSDMD-NT 的 WT、BAX-/-、BAK-/- 和 BAK-/-BAX-/- HEK293T 细胞对 SYTOX Green 的吸收。正如预期的那样，GSDMD-FL 的表达在任何细胞中都不会导致细胞死亡，而 GSDMD-NT 的表达在 BAX 和/或 BAK 缺失的细胞中与在 WT HEK293T 中一样同样诱导焦亡，这表明 BAX 和 BAK 并不参与 GSDMD 介导的线粒体损伤。为了确定 mPTP 是否参与其中，用 mPTP 关键组分（腺嘌呤核苷酸转运体 1 [ANT1]、环嗜蛋白 D [CYPD]、电压依赖性阴离子通道 [VDAC] 和线粒体磷酸盐载体 [PiC]）的抑制剂预处理 iBMDMs，并通过 TMRM 染色和 SYTOX Green 摄取评估 LPS+ nigericin 诱导的焦亡。线粒体去极化和细胞死亡仅受到 mPTP 抑制剂的轻微影响，这表明 mPTP 并未对焦亡线粒体损伤产生重大影响。

 实验结果5 

GSDMD-NT 在体外损伤离体线粒体

  为了确定 GSDMD-NT 本身是否会结合并破坏线粒体膜，用重组 GSDMD 和 caspase-11 处理分离的线粒体以生成活性 GSDMD-NT，并通过对释放的线粒体蛋白进行免疫印迹来评估线粒体的通透性（图 4A 和 4B）。可溶性线粒体基质蛋白（ACO2）和 IMS 蛋白（细胞色素 c 和 HtrA2）在同时加入 caspase-11 和 GSDMD 后 5 分钟内从线粒体中释放出来，但不包括与膜结合的 COX IV。正如预期的那样，泛aspase 抑制剂 z-VAD-FMK 可抑制释放。加入 t-Bid 后，细胞色素 c 和 HtrA2 被释放，但 ACO2 没有释放，t-Bid 触发了 MOMP，但没有破坏细胞凋亡中的 IMM。当线粒体与 GSDMD 和 caspase-11 共同孵育时，mtDNA 也被释放，但单独或与 t-Bid 共同孵育时则没有释放（图 4C）。通过 MitoSOX Red 和 DiIC1(5)染色法，GSDMD 和 caspase-11 处理分离的线粒体也分别显著增加了 ROS 和降低了膜电位（图 4D 和 4E）。因此，GSDMD-NT 可直接渗透 OMM 和 IMM，而无需其他因素。

  为了证实 GSDMD-NT 孔在线粒体膜损伤中的作用，在加入 GSDMD 和 caspase-11 之前先将分离的线粒体与 DSF 预孵育（图 4F 和 4G）。DSF 阻止了线粒体释放细胞色素 c 和 mtDNA，证实了 GSDMD-NT 孔能使线粒体通透。

 实验结果6 

GSDMD-NT 介导的线粒体损伤需要 OMM 心肌磷脂

  由于 GSDMD-NT 与心磷脂具有很高的亲和力，而线粒体膜不含其他已知的与 GSDMD-NT 结合的脂质，因此作者假设线粒体损伤取决于线粒体心磷脂。心磷脂由 CRLS1 合成，并由 PLSCR3 外化至 OMM（图 5A）。为了研究 OMM 心磷脂是否为 GSDMD-NT 介导的线粒体损伤所必需，作者在 iBMDMs 中对 Crls1 和 Plscr3 进行了基因消减。在 Plscr3-/- 和 Crls1-/- iBMDMs 中表达的 GSDMD 含有一个内部 mNeonGreen 标记，正好位于 caspase 的裂解位点之前。在经 LPS+ nigericin 处理的 Crls1-/- 和 Plscr3-/- iBMDMs 中，GSDMD-NT 没有被招募到线粒体（图 5B），线粒体完整性和膜电位（图 5C）、线粒体数量和平均长度以及受损线粒体百分比（图 5D 和 5E）几乎恢复到未经处理的 WT iBMDMs 中的水平。此外，线粒体 ROS以及细胞色素 c 和 mtDNA 的胞浆释放（图 5F-5I）也被阻断。同样，用 GSDMD 和 caspase-11 处理 Crls1-/- 和 Plscr3-/- iBMDM 的分离线粒体也不会释放细胞色素 c、HtrA2 或 mtDNA。综上所述，这些数据表明 OMM 心肌磷脂介导了 GSDMD 依赖性线粒体损伤。

 实验结果7 

OMM 心肌磷脂促进焦亡、IL-1β 释放和抗肿瘤免疫力

  为了评估 OMM 心肌磷脂和线粒体损伤在焦亡中的重要性，比较了经 LPS+ nigericin 处理的 Plscr3-/-、Crls1-/- 和 WT iBMDMs（图 5J-5M）。膜损伤的上游事件，包括 ASC斑点的形成、caspase-1 和 GSDMD 的裂解以及 GSDMD 的寡聚化，不受 Plscr3 和 Crls1 基因消减的影响，但与 WT iBMDMs 相比，Plscr3-/- 和 Crls1-/- iBMDMs 中 GSDMD 靶向质膜、PI 摄取和 LDH 释放减少了 2 倍以上（图 5J-5M）。重要的是，Plscr3 或 Crls1 的基因消减可抑制 IL-1β 的释放。在沙门氏菌诱导焦亡或异位表达 I105N GSDMD-NT 的 iBMDMs 中也得到了类似的结果。

  为了研究线粒体损伤在体内的免疫学作用，在小鼠巨噬细胞肿瘤细胞系J774中对Plscr3进行了基因消减（图5N）。与对照 sgRNA 转导的 WT 细胞相比，LPS+nigericin 刺激的焦亡在 Plscr3-/- J774 细胞中明显减少（图 5O）。焦亡会导致免疫性细胞死亡（ICD），而细胞毒性药物丝裂霉素 C（MMC）不会。为评估线粒体损伤在焦亡 ICD 中的重要性，将 LPS+nigericin 或 MMC 处理的对照组或 Plscr3-/- J774 与 WT J774 混合并皮下注射到小鼠体内。暴露于经 nigericin 处理的 Plscr3-/- J774 的肿瘤比暴露于经 nigericin 处理的 WT J774 的肿瘤生长更快，而经 MMC 处理的 J774 细胞中 PLSCR3 的缺乏并不影响肿瘤生长（图 5P）。与焦亡的免疫原性相一致，暴露于 MMC 处理过的 J774 的肿瘤比暴露于 LPS+ nigericin 处理过的 J774 的肿瘤生长快得多。这些数据表明，线粒体损伤促进了焦亡诱导的体内抗肿瘤免疫。

 实验结果8 

增强焦亡需要 CRLS1 和 PLSCR3 的活性和线粒体定位

  为了证实 OMM 心肌磷脂在焦亡中的重要性，作者在 Plscr3-/- iBMDMs 中表达了 WT PLSCR3 或将 Cys159-161-163-164-166 突变为 Ala 的 PLSCR3（PLSCR3-5A），后者会导致 PLSCR3-5A 错定位到细胞核 。WT PLSCR3（而非 PLSCR3-5A）可挽救 nigericin 或沙门氏菌诱导的焦亡，表明 PLSCR3 线粒体定位是促进焦亡所必需的。同样，质膜扰乱酶 Plscr1 的基因消减并不影响 nigericin 或沙门氏菌诱导的焦亡。为了研究是否需要 PLSCR3 干扰酶活性来促进焦亡，用 WT Plscr3 或编码 Phe259 突变的 Plscr3（Phe259 突变会破坏 PLSCR3 的活性）来拯救 Plscr3-/- iBMDMs。WT 而非 F259V 的 PLSCR3 能恢复 LPS+ nigericin- 或沙门氏菌诱导的 PI 摄取和 LDH 释放。同样，在 Crls1-/- iBMDMs 中，表达 WT CLRS1（而非 D170A CRLS1，后者会破坏心磷脂的合成）可挽救 LPS+nigericin- 或沙门氏菌诱导的焦亡。不出所料，Plscr3 或 Crls1 的 KO 或突变不会影响 GSDMD 和 IL-1β 在这些炎性体激活剂作用下的裂解。因此，活性 PLSCR3 和 CRLS1 是促进焦亡所必需的。

  由于线粒体 ROS 能增强焦亡（图 2F-2L），作者思考线粒体 ROS 本身是否能挽救 Plscr3-/- 和 Crls1-/- 细胞中的焦亡缺陷。用复合体 I 抑制剂鱼藤酮预处理 LPS 激发的 Plscr3-/- 和 Crls1-/- iBMDMs，以增加线粒体 ROS，然后用 nigericin 刺激。虽然鱼藤酮同样增加了 WT、Plscr3-/- 和 Crls1-/- iBMDM 的线粒体 ROS，但鱼藤酮适度增加了 WT 细胞的 PI 摄取，但没有增加 Plscr3-/- 或 Crls1-/- 细胞的焦亡。当其他电子传递链（ETC）复合物被抑制时，Plscr3-/- 和 Crls1-/- 细胞中的焦亡也没有增强。因此，在没有暴露的心磷脂的情况下，线粒体 ROS 本身不能启动焦亡。

 实验结果9 

ROS 和焦亡增加 OMM 心肌磷脂

  在基础条件下，心磷脂主要在 IMM 上，但需要在 OMM 的外叶上才能与细胞质中的 GSDMD-NT 发生反应，导致线粒体损伤。作者假设，GSDMD-NT 可通过与基线时暴露出心磷脂的少数线粒体结合来启动线粒体损伤，但随着线粒体损伤的发生，更多的线粒体会迅速暴露出心磷脂。为了验证这一观点，作者首先用抗心磷脂染色法检测了从未经处理的细胞中分离出来的线粒体是否暴露了心磷脂（图 6A 和 6B）。∼10%的分离线粒体对表面的心磷脂进行了染色，Triton X-100渗透后，心磷脂染色增加了7倍，这表明分离的线粒体是完整的，在基线期，一些线粒体暴露了心磷脂，使其可以被GSDMD-NT所利用。用活性 GSDMD-NT 而非 GSDMD-FL 处理离体线粒体时，心磷脂外暴露在 45 分钟内显著增加（图 6C）。外部心磷脂平均荧光强度（MFI）增加了 1.7 倍，24% 的线粒体被抗心磷脂染色。线粒体氧化剂、抗霉素 A、鱼藤酮或 4-(三氟甲氧基)苯基腙（FCCP）诱导的线粒体 ROS 也增加了心磷脂的暴露量（图 6D）。因此，GSDMD-NT 和线粒体 ROS（由 GSDMD-NT 触发）增加了心磷脂暴露，这可能会扩大 GSDMD 结合和线粒体损伤。由于有报道称细胞凋亡会将心磷脂分布到质膜上，作者接下来用心磷脂染料壬基吖啶橙（NAO）染色，考察了加入尼格列汀后心磷脂的定位是否发生了变化。在引发焦亡前后，NAO标记的心磷脂与MitoTracker共聚焦，而没有染上细胞膜，这表明心磷脂在线粒体中发挥作用，在焦亡过程中没有整合到质膜中。

 实验结果10 

线粒体在焦亡过程中释放 PNPT1，导致全局 mRNA 衰减

  在细胞凋亡过程中，MOMP 会释放 PNPT1（IMS 中的一种外切核酸酶），启动全局 mRNA 降解，从而促进细胞凋亡。由于焦亡也会触发 MOMP，因此 PNPT1 很可能也会释放到细胞膜，并在焦亡过程中触发 mRNA 降解。为了验证这一观点，作者通过免疫荧光显微镜和免疫印迹法分析了 PNPT1 在 LPS- 和 LPS+ nigericin 处理的 iBMDM 中的定位情况（图 5F、5G、7A 和 7B）。在 LPS 诱导的细胞中，PNPT1 定位于线粒体，但加入 nigericin 后则移至细胞膜。不出所料，PNPT1 在 Plscr3-/- 和 Crls1-/- iBMDM 中释放受阻（图 5F 和 5G）。通过荧光原位杂交检测 18S rRNA 和 poly(A) mRNA，在 WT 中检测不到 mRNA 信号，而在 Plscr3-/- 和 Crls1-/- iBMDMs 中 rRNA 没有明显变化（图 7C 和 7D）。一致的是，在 WT 而非 Plscr3-/- 或 Crls1-/- iBMDMs 中，Actb、Tuba 和 Sdha 管家基因 mRNA 在加入 nigericin 后 30 分钟内或沙门氏菌感染后 60 分钟内急剧下降（图 7E）。此外，分别在 Plscr3-/- 和 Crls1-/- iBMDMs 中异位表达 WT PLSCR3 和 CRLS1，而非它们的非活性形式，可恢复由 nigericin 或沙门氏菌诱导的焦亡 mRNA 衰减（图 7F 和 7G）。因此，OMM 心肌磷脂是 PNPT1 诱导的焦亡 mRNA 降解所必需的。

  为了研究 PNPT1 介导的 mRNA 降解是否有助于焦亡，用 nigericin、LPS 转染或沙门氏菌处理 WT 和 Pnpt1-/- iBMDM（图 7H-7K）。Pnpt1 缺乏会明显减轻焦亡，但不会影响 nigericin 诱导的 PNPT1 释放上游事件，包括 caspase-1 和 GSDMD 的裂解、GSDMD 的寡聚化和与线粒体和质膜的结合，或线粒体形态变化、ROS 或 mtDNA 释放。为了证实 PNPT1 RNase 活性对促进焦亡至关重要，在 Pnpt1-/- iBMDMs34 中表达了 WT 或 RNase 缺失的 S484A PNPT1（图 7L）。异位 WT 而非 RNase 缺失的 PNPT1 可挽救 nigericin 诱导的焦亡，这表明 PNPT1 介导的 mRNA 衰变促进了焦亡。

 实验结果11 

GSDMA 和 GSDME 介导的焦亡需要线粒体损伤

  为了评估线粒体在其他 GSDMs 引发的焦亡中的作用，在 WT、PLSCR3-/-、CRLS1-/- 或 PNPT1-/- HEK293T 细胞中异位表达 GSDMA-NT 或 GSDME-NT。在 PLSCR3-/-、CRLS1-/-或 PNPT1-/- HEK293T 细胞中，过表达的 GSDMA-NT 或 GSDME-NT 的 LDH 释放和 PI 摄取被减弱，这表明线粒体损伤增强了这些其他 GSDM 诱导的焦亡细胞。

  为了检测 OMM 心肌磷脂是否在其他形式的程序性细胞死亡中发挥作用，WT、Plscr3-/- 和 Crls1-/- iBMDMs 分别接受依托泊苷、TNF-α+ 环己亚胺（CHX）或 LPS+zVAD 处理，以诱导细胞内在凋亡、外在凋亡和坏死性凋亡。干扰心磷脂合成或 OMM 外化并不影响凋亡，但意外地显著减轻了坏死。了解心磷脂在坏死性凋亡中的作用还需要进一步研究。

 讨论 

  在这里，作者已经证明，在人和小鼠巨噬细胞中，线粒体在 GSDMD 介导的焦亡过程中通过 BAX、BAK 和 mPTP 非依赖性途径受到严重破坏。线粒体损伤取决于心磷脂 OMM 暴露，因为心磷脂合成酶 CRLS1 或扰乱酶 PLSCR3 缺乏时，线粒体损伤的所有方面几乎都会减弱。GSDMD-NT 可使两种线粒体膜通透，造成严重的形态损伤，破坏电子传递、ATP 生成和跨膜电位，诱发 ROS、有丝分裂，并将可溶性线粒体蛋白和 mtDNA 释放到细胞膜和培养液中。此外，任何一种基因的消减都会破坏焦亡，只有具有酶活性的基因产物才能挽救焦亡。线粒体 ROS 会增加心磷脂 OMM 暴露，从而增强焦亡，但不可能是唯一的重要因素，因为与基因消减 Crls1 或 Plscr3 相比，使用线粒体 ROS 清除剂 MitoTEMPO 减少线粒体 ROS 或通过向表达酵母 D-氨基氧化酶的细胞提供 D-Ala 诱导细胞质 ROS 对焦亡的影响较小、 线粒体毒素诱导 ROS 并不能使 Plscr3 或 Crls1 基因缺陷细胞恢复焦亡。

  线粒体破坏发生迅速，几乎与炎症小体激活同时发生，而且发生在细胞膜损伤之前。作者提出了一个简单的两步模型，即裂解的 GSDMD 与 OMM 心磷脂快速结合，形成孔隙，使 OMM 通透化，然后立即与 IMM 上的心磷脂结合，破坏 IMM。为支持这一模型，GSDMD 在细胞膜上被检测到之前就已迁移到线粒体上，当分离出的线粒体与 caspase-11 和 GSDMD 体外培养时，两层膜都会被渗透。除 GSDMD-NT 外，破坏线粒体不需要其他细胞膜蛋白。尽管 t-BID 在体外释放的 IMS 蛋白比 GSDMD-NT 多，但凋亡性线粒体损伤比凋亡性损伤更剧烈，后者不会直接损伤 IMM。

  GSDMD-NT 造成的线粒体损伤很可能是焦亡的 "不归点"，类似于 MOMP 在经典凋亡中的作用。在某些情况下，细胞在炎症小体激活和 GSDMD-NT 孔形成后仍能存活，尽管它们会释放炎症介质，这一过程被称为 "超激活 "。在超激活存活的细胞中，线粒体损伤可能更为有限，从而留下更多的功能线粒体来供应细胞能量需求。事实上，巨噬细胞中的非典型炎症小体激活后，细胞不会因氧化磷脂而死亡，这增加了线粒体的耗氧量，导致线粒体代谢亢进。不同的线粒体损伤可能意味着激活刺激物、传感器或焦亡介质的浓度在过度激活的细胞中降低了，或者在某些细胞中存在抑制焦亡线粒体损伤的未知机制。

  线粒体损伤的快速性可能与 GSDMD-NT 对心磷脂的高亲和力（与质膜磷脂相比）有关。虽然无法判断质膜 GSDMD-NT 是来自受损的线粒体还是细胞质，但最合理的假设是受损的线粒体和线粒体膜结合的 GSDMD-NT 在丝裂噬体中被清除和消化，而质膜 GSDMD-NT 直接来自细胞质 GSDMD-NT，当作者观察到 GSDMD 膜点时仍能检测到细胞质 GSDMD-NT。有研究表明，NLRP3 炎症小体是以一种依赖于心磷脂的方式在线粒体上聚集的。如果是这样的话，GSDMD 的裂解可能发生在 OMM，从而导致 GSDMD-NT 快速靶向线粒体。由于线粒体损伤及其所有相关现象发生得太快，作者无法明确确定最初的触发因素。虽然在其他变化之前检测到了线粒体 ROS，但目前还不清楚它是一个触发因素还是仅仅是检测到的第一个变化。基础 OMM 上存在一些心磷脂，用活性 GSDMD 处理线粒体或诱导 ROS 后，心磷脂增加。这一发现表明，基础 OMM 心肌磷脂启动了一轮 GSDMD 孔组装的先驱，导致产生 ROS 和更多的 OMM 心肌磷脂暴露，从而扩大了这一途径。缺乏焦亡线粒体损伤介质的 HEK293T 细胞的 GSDMA 和 GSMDE 介导的焦亡功能受损，这证实了之前的工作，即其他 GSDM 也会损伤线粒体。事实上，Caspase-3 激活的 GSDME-NT 可使线粒体膜通透化，从而增加神经元损失和/或细胞死亡。

  焦亡裂解线粒体损伤会扩大炎症和对感染、组织损伤和癌症的免疫反应。事实上，抑制线粒体损伤会减弱体内焦亡引发的抗肿瘤免疫。线粒体 ROS 可扩大 NLRP3 的激活并引发 OMM 转移心磷脂。线粒体 ROS 还可能通过促进 GSDMD 的寡聚化和孔隙形成而促成焦亡。ROS 通过氧化未配对的 Cys 并使其易于发生棕榈酰化，从而增加棕榈酰化。由 GSDMD 介导的线粒体损伤所产生的线粒体 ROS 可能在促进这种翻译后修饰方面发挥了关键作用，并在增加细胞死亡方面发挥了重要作用。GSDMD-NT 棕榈酰化还可能增加线粒体膜结合。

  在 iBMDMs 中遗传性消减 Plscr3 或 Crls1 可使 30 分钟内 SYTOX 的吸收和 LDH 的释放减少 2 倍以上，这是质膜通透性降低的迹象，但 IL-1 的释放却完全受阻。IL-1β 的释放需要 IL-1 的处理和通过质膜 GSDMD 孔的释放，但 Plscr3 或 Crls1 的基因消减并不影响 IL-1 的处理，这表明线粒体损伤在 IL-1β 通过 GSDMD 孔的释放中起着关键作用。作者不明白为什么抑制线粒体损伤比抑制细胞死亡对 IL-1β 释放的影响更大。一种可能是 ROS 比孔隙形成更能促进 IL-1 的分泌，这值得进一步研究。IL-1β 的释放对线粒体损伤的强烈依赖性确定了线粒体损伤扩大体内炎症的另一种重要方式。

  与内叶磷脂酰丝氨酸外化到细胞膜外叶作为凋亡细胞的 "吃我信号 "类似，OMM 心肌磷脂也是受损线粒体的有丝分裂 "吃我信号"。IMM IMS 一侧的心磷脂氧化也会促进细胞色素 c 的释放。在线粒体焦亡损伤过程中从基质和 IMS 释放的分子预计也会有效促进细胞死亡，并可能触发其他细胞死亡途径。细胞色素 c 的释放应导致凋亡小体的形成，从而激活 caspase-3 裂解 Bid，引起 BAK 和 BAX 介导的 MOMP，并裂解 GSDME，扩大 GSDME 表达细胞的焦亡。然而，在该研究中，BAX/BAK缺陷细胞的细胞死亡并没有减少。尽管活化的 Caspase-3 可触发细胞凋亡，但细胞凋亡的发生速度比焦亡慢，而且如果质膜完整性已被破坏，就不太可能发生细胞凋亡，因为完成细胞凋亡需要有活力的细胞。然而，激活细胞凋亡可以杀死原本过度活跃的细胞。与细胞凋亡一样，焦亡过程中线粒体 PNPT1 的释放导致广泛的 mRNA 降解，从而导致细胞死亡。尽管焦亡过程中 PNPT1 的释放机制不同（依赖 GSDMD 和心磷脂的 PNPT1 与依赖 BAX 和 BAK 的 MOMP 不同），但一旦该酶进入细胞质，其作用机制相同--PNPT1 降解 mRNA。在 GSDMD 介导的线粒体损伤过程中释放到细胞质中的 mtDNA 是一种有效的危险信号，可同时激活环 GMP-AMP 合成酶（cGAS）和 AIM2。因此，GSDMD 介导的线粒体损伤应该会增加细胞的死亡承诺。线粒体 ROS、mtDNA 和心磷脂也可作为损伤相关分子模式来放大炎症。线粒体 ROS 对心磷脂、mtDNA 和其他分子的氧化作用也会促进其他炎症和细胞死亡途径。

  不过，线粒体损伤的放大效应可能只在某些情况下才具有重要的生理意义。例如，在对 nigericin 的反应中，与 WT iBMDMs 相比，基因上消减了 Crls1 和 Plscr3 的 iBMDMs 并未显示出 ASC斑点形成、caspase-1 分裂或 GSDMD-NT 生成和寡聚的减少。相反，转染的 LPS 对非典型炎性体的激活会二次激活 AIM2斑点。作者对这种差异的解释是，较强的焦亡诱导剂的二次放大作用可能不会发生或影响细胞是否死亡，但对于较弱的诱导剂可能会变得重要。未来的研究应探讨不同类型的细胞和不同的焦亡刺激会激活哪些次级放大途径。

  质膜中与 GSDMD-NT 结合的磷脂也存在于内质体、吞噬体和溶酶体的外小叶上，过氧物酶体膜上也发现了心磷脂，这表明这些其他细胞器膜也可能在焦亡过程中受损。溶酶体在调节耶尔森菌感染诱导的焦亡中的重要性最近已得到证实--溶酶体 Rag-Ragulator 复合物是激活 GSDMD 的平台，其途径涉及 TLR 或死亡受体信号、RIPK1 和 caspase-8。GSDM-NT 是否会在溶酶体和其他细胞器膜上形成孔，以及其他细胞器的损伤是否和如何导致焦亡，都值得研究。

  先前的一项研究利用高分辨率成像技术显示，用 BH3 拟态药物处理活的永生小鼠胚胎成纤维细胞后，mtDNA 被释放到细胞膜中，从而刺激经典的凋亡性 BAK 和 BAX 依赖性 MOMP。疝出的 IMM 被推测为爆裂，但没有明确的机制基础。作者关于 GSDMD-NT 孔隙渗透 IMM 并导致 mtDNA 释放的模型描述了破坏 IMM 的潜在机制。可以想象，在多种情况下观察到的 mtDNA 释放可能是由 GSDM 破坏线粒体膜介导的，特别是因为除了炎症性 caspase 外，caspase-3 和 caspase-8 可分别激活 GSDME 和 GSDMD，而且 GSDM 也可被细胞质中其他错位或激活的蛋白酶激活。

 来源：Chestnut Studying