外泌体相关研究文献分享,轻松读完一篇文献（二十四）

今天分享一篇发表在lass="nolink">Science Advances上的文章，名为《Simultaneous subset tracing and miRNA profiling of tumor-derived exosomes via dual-surface-protein orthogonal barcoding》[1]（通过双表面蛋白正交条码对肿瘤源性外泌体进行同时子集追踪和miRNA分析）。

MicroRNAs (miRNAs)是一类短、非编码、单链RNA（大约22核苷酸），通过抑制靶基因的翻译或降解其靶转录产物，在基因表达调控中发挥基本作用。失调的miRNAs与多种癌症的发病机制密切相关，因此已被研究作为癌症诊断、预后和治疗监测的新兴生物标志物。然而，miRNAs在液体活检中的临床价值受到研究人员的质疑，原因是它们在体液中存在各种来源和形式，如游离循环miRNAs、与核糖核蛋白结合的miRNAs或封装在不同细胞外囊泡中的miRNAs。生物标志物的非特异性来源降低了miRNAs作为诊断工具的准确性，成为从概念验证迈向临床应用的绊脚石。外泌体是通过内体和多囊体途径产生的一类独特的细胞外囊泡亚型。miRNAs被有选择地包装和富集在外泌体中，作为生理和病理过程的调节因子，并在脂质膜的保护下保持稳定。特别是肿瘤源性外泌体miRNAs与癌症进展密切相关，为提高基于miRNA的液体活检的特异性和准确性提供了巨大的希望。很遗憾，由于复杂的背景干扰、异质性细胞外囊泡亚型以及不同外泌体miRNA的表达水平差异，肿瘤源性外泌体的特异性识别和外泌体miRNA的定量检测仍然存在技术挑战。此外，现有的miRNA分析需要多个手动步骤并且耗时较长。因此，开发一种灵敏、准确且简化的生物测定方法，用于在复杂的生物流体样本中定量测定肿瘤源性外泌体miRNA，对于推动临床可行的癌症miRNA生物标志物的发展至关重要。

目前的RNA定量技术，如定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）和第二代测序，能够以飞摩尔级（fM）的高灵敏度检测外泌体中特定的miRNA种类。然而，这些定量技术通常需要大样本体积（>500 μl），在RNA分析之前分离足够的外泌体，同时还涉及繁琐和耗时的程序，包括外泌体裂解、RNA提取、cDNA生成和序列扩增。此外，这些分析容易受到生物体液中游离miRNA的干扰，其丰度比外泌体miRNA高出数个数量级。作为基于序列扩增策略的替代，近期已经通过直接或间接导入DNA探针到膜囊泡中[如金纳米分子（Au NFs）和分子信标（MBs）]开发了一系列原位外泌体miRNA生物分析方法。有研究者设计了一种病毒模拟融合囊泡封装的MBs探针，能够通过膜融合在2小时内迅速检测到胞外囊泡miRNA。另有研究者提出了一种热泳动传感器，用于原位胞外囊泡miRNA分析，通过将Au NFs传输到囊泡中，在0.5 μl血浆样本中显示出0.36 fM的检测灵敏度。这些原位技术提供了高效且稳定的胞外囊泡miRNA检测，无需繁琐的RNA提取，并消除了复杂生物体液样本的背景干扰。然而，miRNA探针进入囊泡是随机的，无法区分肿瘤源性外泌体与其他非特异性囊泡。对总外泌体miRNA的集成检测掩盖了肿瘤源性外泌体miRNA的特异性，降低了液体活检应用的准确性。

肿瘤源性外泌体仅占EVs的一小部分，这使得精确区分它们与其他物质变得具有挑战性。表面蛋白受体通常被用来识别各种不同的胞外囊泡的独特亚型。典型的，跨膜四蛋白CD63与其他囊泡相比在外泌体中富集，上皮细胞粘附分子EpCAM是肿瘤的典型标志物。这两种蛋白的正交组合设定了一个更为重要的阈值，并在识别和分拣肿瘤源性外泌体方面具有巨大潜力。最近有报道基于多受体的DNA逻辑装置，将多个适配体结合成单个计算设备，能够识别细胞和外泌体的亚群。例如，有人开发了一种Adleman-Nishimura-Deamer（AND）布尔逻辑装置，利用多个适配体和脚手架激活进行信号整合和放大，通过不同表面蛋白受体的协同存在标记和识别目标细胞类型。我们的团队报道了双表面蛋白-适配体识别结合液滴数字PCR实现了肿瘤源性外泌体程序性细胞死亡1配体1（PD-L1）的定量分析。然而据我们所知，这种多蛋白受体协同逻辑装置尚未用于选择性识别和分拣外泌体亚型。

应对这些挑战，我们在这里开发了双表面蛋白引导的肿瘤源性外泌体的正交识别和微小RNA的原位探测（SORTER）配置文件，用于快速和特异性检测肿瘤源性外泌体miRNA。SORTER相对于现有的外泌体miRNA生物传感测定具有三个显著优势。首先，我们提出了一种双表面蛋白引导的正交标记策略，以精确识别和分拣肿瘤源性外泌体，这是一种小但相当可观的胞外囊泡亚群，提高了基于外泌体的液体活检的诊断和预测准确性。具体而言，外泌体特异标记物CD63和肿瘤标记物EpCAM的双变构适配体被用于在肿瘤源性外泌体上创建一个独特的正交身份条形码，从而诱导miRNA探针的定向识别和受控融合，以进行信号放大。其次，在外泌体的膜结构内原位检测miRNA可防止游离循环miRNA的污染和核糖核酸酶（RNases）的降解，从而实现对肿瘤源性外泌体miRNA的准确定量甚至是动态监测。第三，我们将多个过程整合到SORTER中，如外泌体识别、引入探针、miRNA信号转导和放大，并创建了无分离和无洗涤的肿瘤源性外泌体miRNA测定。SORTER在液体活检应用中提供了卓越的分析性能，仅消耗0.2 μl的血浆样本，并在不到2小时内完成整个分析。我们在训练组（n = 42）和验证组（n = 32）中测试了六种miRNA（miR-222、miR-1290、miR-182、miR-21、miR-221和miR-10b）的外泌体标志物，能够以100%的灵敏度、特异性和准确性区分前列腺癌（PCa）和良性前列腺增生（BPH）。这个诊断准确率在转移性和非转移性前列腺癌（nPCa）的分类中也达到了90.6%。我们预见到SORTER提供了一个有前景的工具，可以推进肿瘤源性外泌体miRNA分析，并促进基于miRNA的液体活检在临床上的适用性。

研究结果：

一、SORTER工作原理

检测工作流程包括三个部分（图1A，步骤I至III），包括样本收集和血浆制备，用于肿瘤源性外泌体miRNA分析的SORTER检测，以及癌症诊断的生物统计分析。SORTER检测旨在实现对肿瘤源性外泌体亚型的特异性识别和排序，以及对肿瘤源性外泌体miRNA谱的原位灵敏探测，从而进一步提高前列腺癌基于miRNA的诊断准确性。SORTER包括多个并行过程（图1B，步骤I至III），包括对肿瘤源性外泌体进行条码标记，miRNA检测探针的有针对性导入，以及对肿瘤源性外泌体miRNA的原位分析，从而实现对肿瘤源性外泌体中miRNA的敏感和精确的一步法分析。SORTER的两个重要创新是通过双表面蛋白引导的正交识别实现对肿瘤源性外泌体的选择性标记和排序，以及通过双链特异性核酸酶（DSN）催化的信号放大进行miRNA的原位敏感定量。

在血浆中，没有单一标志物可以选择性地区分miRNA的异质性来源。例如，在血浆样本中，肿瘤源和正常来源的外泌体、微囊泡、以及游离分子（例如，RNA-蛋白质复合物）共存，并具有重叠的组成特性。因此，我们利用两种典型的表面蛋白标记物的组合，CD63用于外泌体特异性标记物，EpCAM用于肿瘤特异性标记物，建立了一个正交筛选阈值，从而能够精确识别复杂生物流体样本中的肿瘤源性外泌体。由于适配体aptamers具有出色的特异性和亲和性、低生产成本以及构型可编程性，它们是蛋白质标记的有希望的工具。我们设计了两个CD63和EpCAM的异构适配体探针，作为在临床样本中对肿瘤源性外泌体进行正交标记的输入单元。这两个异构适配体探针（CD63-S-L和EpCAM-S-L）包括三个结构域：适配体（CD63或EpCAM）结构域、间隔（S）结构域和连接器（L）结构域。异构适配体探针处于非活性状态，具有发夹结构，其中L结构域被阻断以进行后续反应。当两个蛋白受体CD63和EpCAM在单个外泌体上协同识别时，通过异构转变引起两个不同的L结构域暴露，通过近场诱导的自组装在肿瘤源性外泌体上创造一个独特的正交身份条码。特别是，未结合的适配体探针仍然处于非活性状态，因此不需要冲洗掉多余的探针。双目标蛋白引导的正交条码方法可在临床样本中迅速且选择性地标记肿瘤源性外泌体（图1B，步骤I），避免了冗长的前分离/纯化过程，并最小化受污染囊泡的非特异性干扰。

肿瘤源性外泌体miRNA的定量面临两个主要挑战：（i）血液中循环的游离miRNA的数量比肿瘤源性外泌体中的目标miRNA高出几个数量级，对检测造成严重干扰；（ii）肿瘤源性外泌体中miRNA的浓度极低（约为1拷贝/10^6个EVs~1拷贝/1个EV），因此需要一种极高灵敏度的测定方法进行miRNA的分析。为了解决这些问题，我们设计了一种智能脂质体探针（Tags-Lipo@Au NFs），通过靶向囊泡融合将miRNA检测探针引入肿瘤源性外泌体，实现多种miRNA在外泌体内的原位灵敏定量。我们利用肿瘤源性外泌体上的正交条形码（Orth-Exo）与固定在脂质体探针上的互补DNA标签（Tags-Lipo@Au NFs）以拉链样的形式（图1B，步骤II）杂交，促进对肿瘤源性外泌体的选择性识别和miRNA检测探针的同时引入。随后，利用封装在脂质体探针中的Au NFs和DSN，生成并放大miRNA的荧光信号（图1B，步骤III）。具体而言，Au NFs通过将识别序列（50 -硫醇（SH）和30 -羧基荧光素（FAM）标记）固定到球形Au纳米颗粒上制备而成，其中荧光被Au表面有效熄灭，大大减小了背景信号。目标miRNA将与纳米荧光探针中的DNA探针结合形成DNA-RNA杂交二聚体。值得注意的是，DSN将特异性地剪切DNA-RNA杂交二聚体中的DNA序列，释放出用于荧光和RNA序列的荧光基团，并启动目标回收和信号放大过程。在外泌体膜结构内的原位miRNA测定消除了循环游离miRNA的干扰，Tags-Lipo@Au NFs探针提供了最小化的背景和放大的荧光信号，从而实现对肿瘤源性外泌体中目标miRNA的高度选择性和灵敏定量。

二、肿瘤来源外泌体上的双表面蛋白正交条码标记

四膜蛋白，尤其是CD63、CD9和CD81，是区分外泌体与其他非特异性外泌体（如微囊泡或凋亡体等）的最常用标志物。当前主流文献主要使用CD63适配体进行外泌体的识别和分离。为了区分肿瘤和正常细胞衍生的外泌体，我们选择了一个包含九个外泌体膜蛋白标记物的panel：一个外泌体蛋白标记物（CD63）和八个潜在的肿瘤蛋白标记物，包括EpCAM、核仁蛋白、癌胚抗原、人表皮生长因子受体2、粘蛋白1、PD-L1、前列腺特异性膜抗原和蛋白激酶7。前列腺癌细胞（LNCaP、DU145、PC-3）和前列腺增生细胞（BPH-1）衍生的外泌体被用作肿瘤来源和正常来源外泌体的模型。使用FAM标记的适配体探针分别结合单个外泌体上的目标蛋白。与BPH-1 Exo相比，对LNCaP Exo、DU145 Exo和PC-3 Exo的纳米流式（NanoFCM）分析显示EpCAM的标记效率最高（范围从43.1%到75.1%），CD63的标记效率相对较高（范围从16.2%到48.7%）。此外，统计分析显示NanoFCM与四个细胞系来源的外泌体中九种蛋白标记物在酶联免疫吸附法中表达的相关性相当强（Pearson's r = 0.8736）。因此，协同识别CD63（外泌体标志物）和EpCAM（肿瘤标志物）的目标蛋白是识别和分离肿瘤来源外泌体的最佳选择。

为了在复杂的临床场景中快速而选择性地为肿瘤来源的外泌体标记可追踪的条码，我们设计了两个CD63和EpCAM蛋白的变构适配体探针，作为肿瘤来源外泌体的正交标记的输入单元。这些变构适配体探针（CD63-S-L或EpCAM-S-L）包含三个结构域：适配体（CD63或EpCAM）结构域，间隔（S）结构域和连接（L）结构域。变构适配体探针以其非活跃状态的发夹结构存在，L结构域被退火并阻塞了下游反应。变构适配体探针的适配体结构域可以特异性地识别目标蛋白，通过变构途径使L结构域暴露出来。为了确认CD63-S-L和EpCAM-S-L是否结合到目标蛋白并使L结构域暴露，我们使用荧光共振能量转移（FRET）偶联（BHQ1和FAM）双标记的CD63-S-L和EpCAM-S-L对LNCaP Exo进行荧光动力学分析。这使我们能够通过荧光信号的增加轻松监测变构反应。当CD63-S-L或EpCAM-S-L的两个变构适配体探针与LNCaP Exo一起孵育时，荧光信号显著增加，而在对照实验中几乎没有观察到信号变化（仅使用CD63-S-L或EpCAM-S-L）。这些发现验证了设计的CD63-S-L或EpCAM-S-L变构适配体探针能够高效地结合到外泌体的目标蛋白，并触发变构变化以暴露L结构域，实现对肿瘤来源外泌体的正交条码标记。

为确认CD63和EpCAM是否在单个肿瘤源性外泌体表面共表达，我们使用全内反射荧光显微镜（TIRFM）对标有FAM的CD63-S-L（3‘标记）和标有Cy5的EpCAM-S-L（5’标记）的双标记肿瘤LNCaP Exo和正常BPH-1 Exo进行成像。图2A说明了CD63-S-L（FAM）和EpCAM-S-L（Cy5）介导的正交标记在单个外泌体表面上的情况。在LNCaP Exo的相同颗粒上，CD63（绿点）和EpCAM（红点）的荧光信号相当强烈，合并图像中呈橙色点，而在BPH-1 Exo中仅检测到少量荧光信号的共定位（图2B）。我们进一步通过NanoFCM检查了CD63-S-L（FAM）和EpCAM-S-L（Cy5）在LNCaP Exo和BPH-1 Exo上的标记效率（图2C）。观察到EpCAM-S-L（Cy5）在LNCaP Exo上的标记效率（74.5%）远高于BPH-1 Exo（2.5%），而CD63-S-L（FAM）在LNCaP Exo上的标记效率（45.7%）优于BPH-1 Exo（2.4%）。这些发现表明，CD63和EpCAM蛋白在单个肿瘤源性外泌体表面上表达且共存，并且CD63和EpCAM探针可以有效地标记在同一小囊泡表面上。

为验证正交条码锚定外泌体（Orth-Exo）与胆固醇标记的互补DNA标签（Tags）之间的拉链样杂交，我们检测了CD63-S-L、EpCAM-S-L（5‘标记的Cy5）和Tags（5’标记的FAM）在LNCaP Exo和BPH-1 Exo上的共标记，并通过全内反射荧光显微镜（TIRFM）进行了分析。图2D展示了正交条码和Tags在单个外泌体表面上的拉链样杂交。如图2E所示，与BPH-1 Exo相比，在部分LNCaP Exo上EpCAM-S-L（红点）和Tags（绿点）在同一小囊泡上的共位是明显的（合并图像中的橙点）。此外，当CD63-S-L被rCD63-S-L替代（只替换aptamer域为随机序列）或EpCAM-S-L被rEpCAM-S-L替代时，未观察到共位荧光信号。我们通过NanoFCM进一步检查了CD63-S-L、EpCAM-S-L（Cy5）和Tags（FAM）在LNCaP Exo和BPH-1 Exo上的标记效率（图2F）。Tags（FAM）在LNCaP Exo上的标记效率（51.5%）远高于BPH-1 Exo（0.3%）。当EpCAM-S-L被rEpCAM-S-L替代或CD63-S-L被rCD63-S-L替代时，在LNCaP Exo（0.0或0.1%）和BPH-1 Exo（0.0或0.0%）中均未检测到明显的标记信号。这些研究揭示了在单个源自肿瘤的外泌体表面成功形成正交条码，并在同一小囊泡表面上实现DNA标签和正交条码的有效拉链样杂交。与此同时，我们进一步使用以下荧光序列测量了LNCaP Exo上的标记强度：CD63-S-L（3‘标记的FAM）、EpCAM-S-L（5’标记的FAM）和Tags（5‘标记的FAM）。与CD63-S-L（445.8 a.u.）和EpCAM-S-L（123.58 a.u.）的总和相比，Tags的荧光信号（1032.0 a.u.）升高，表明形成的正交条码提高了变构拮抗体探针的结合亲和力。此外，使用熔化温度估计了单个外泌体表面上正交条码的结构稳定性。这些结果表明，正交条码在小囊泡表面上具有优异的结构稳定性，使得DNA标签和正交条码能够进行有效的拉链样杂交。

DNA探针的主要目标是标记和识别复杂生物液体中的外泌体，比如血浆或尿液。因此，DNA探针在生物液体中必须具有长达数小时的持久耐久性。我们在37°C下孵育2小时后，检查了EpCAM-S-L、CD63-S-L和Tags在不同浓度血浆（从0到14%）中的稳定性。随后对处理后的样品进行琼脂糖凝胶电泳分析。定量结果显示，即使暴露于14%的血浆中，EpCAM-S-L、CD63-S-L和Tags在所有情况下都保持稳定，没有观察到任何明显的降解。此外，我们通过NanoFCM检查了在磷酸盐缓冲盐水（PBS）和100倍稀释的血浆样品中用于标记不同细胞系来源的外泌体的CD63-S-L、EpCAM-S-L（Cy5）和Tags（FAM）的标记效率。与PBS溶液中外泌体的标记效率相比，血浆样品中外泌体的标记效率并未表现出显著的变化，表明这种标记策略适用于在100倍稀释的临床血浆标本中标记肿瘤源性外泌体。

三、双表面蛋白引导下脂质体探针融合的动态监测

DNA标签在脂质体上的杂交反应与肿瘤源性外泌体上的正交条码引导了脂质体和外泌体的有针对性融合。首先通过纳米粒子追踪分析和透射电子显微镜（TEM）对脂质体和LNCaP Exo的形态和大小进行了表征。脂质体和外泌体是典型的球形或杯形小囊泡，直径分别约为143和169nm。为了确认双表面蛋白引导的脂质体探针融合，我们使用基于FRET的分析（图3A）监测了基于融合的膜混合。DNA标签锚定的脂质体（Tags-Lipo）被用3,3'-二十二碳烷基-氧卡波氰化物（DiO; 501 nm）的供体和1,1‘-二十二碳烷基-3,3,3’,3‘-四甲基吲哚卡波氰化物（DiI; 565 nm）的受体进行双标记。融合后，膜被扩大，导致膜表面上DiO和DiI之间的FRET效率降低。如图3B所示，随着Tags-Lipo-DiO-DiI对正交条码锚定的外泌体（Orth-Exo）的摩尔比进一步增加，FRET效率下降。然而，在Lipo-DiO-DiI和没有条码的外泌体（Exo）之间的随机融合中几乎没有观察到融合。膜融合动态也在FRET分析中进行监测。当无荧光的Orth-Exo与双标记的Tags-Lipo（Tags-Lipo-DiI-DiO）一起孵育时，DiO信号迅速增加，并在2小时内达到平台值（图3C），而在Lipo-DiO-DiI和Exo的随机融合中没有变化。这些结果证实了成功的融合确实是通过正交外泌体（Orth-Exo）与Tags-Lipo-DiI-DiO之间类似拉链的杂交所介导的。此外，图3D记录了在不同温度下Tags-Lipo-DiO-DiI和Orth-Exo的融合混合分析结果。随着温度的升高，脂质体（Lipo-DiO-DiI）和外泌体（Exo）的随机融合也增强。因此，37°C是SORTER检测的最佳温度，具有最大化的目标到随机融合效率比。此外，双标记的LNCaP Exo在与Tags-Lipo-DiO-DiI脂质体探针孵育后，CD63和EpCAM异构适配体探针的荧光信号显著增加（P < 0.001）。相比之下，单标记的LNCaP Exo样品使用CD63或EpCAM异构适配体探针时信号变化微乎其微。这些结果表明了脂质体探针与双标记外泌体的特异性融合。另外，我们还评估了经与Tags-Lipo-DiO-DiI脂质体探针孵育后的双标记LNCaP Exo和BPH-1 Exo的融合效率。肿瘤来源的LNCaP Exo比正常的BPH-1 Exo显示出更高的荧光，这表明CD63和EpCAM蛋白的表达水平影响了外泌体和脂质体的融合效率。

为了进一步验证Tags-Lipo和Orth-Exo的有效融合，我们分别用DiI和DiO标记了Tags-Lipo和Orth-Exo（图3E）。Tags-Lipo的DiI荧光（红点）与Orth-Exo中DiO的荧光（绿点）很好地共定位。相比之下，在Lipo-DiI和Exo-DiO之间的随机融合中几乎没有可检测到的共定位荧光信号。值得注意的是，我们观察到大量的Orth-Exo（绿点）围绕着大的重叠颗粒（黄点），表明Orth-Exo和Tags-Lipo-DiI-DiO的正交融合是由DNA编程的级联反应。通过动态光散射（DLS）方法在不同时间间隔内确定了膜融合产物的流体动力学尺寸分布（图3F）。融合小囊泡的直径逐渐从154.7nm增加到206.5nm，而在对照实验中，由于Tags和正交条码之间缺乏类似拉链的杂交，直径几乎没有增加。通过功能化13nm球形金纳米颗粒（Au NP），创造了具有靶向miR-21的识别序列的Au NFs。FAM靠近Au NP表面导致荧光猝灭。DLS测量显示Au NFs的平均尺寸为64nm，每个Au NFs上的识别序列的装载密度确定为75 nM。这些囊泡的透射电镜分析（图3G）显示了制备的单个脂质体或外泌体，这与不完全融合一致。然而，在Tags-Lipo@Au NFs和Orth-Exo融合反应中观察到了半融合中间体或完全融合的状态。这些结果表明了Orth-Exo和Tags-Lipo的有效双表面蛋白介导的正交融合，允许导入封装的miRNA检测探针进行下游分析。

四、肿瘤源性外泌体miRNA分析的SORTER

前列腺癌（PCa）是全球男性最常见的被诊断出的恶性肿瘤之一，与癌症相关的死亡率不断上升。目前，广泛使用的血清前列腺特异性抗原（PSA）筛查在临床PCa的诊断中缺乏足够的特异性和敏感性。患有良性前列腺增生（BPH）的患者经常有升高的PSA水平，导致不必要的前列腺活检和过度治疗。因此，迫切需要开发液体活检方法，以促进PCa的早期诊断，这对于改善长期临床结果至关重要。肿瘤源性外泌体内的miRNA与PCa的发展、侵袭和转移密切相关，是PCa诊断的潜在液体生物标志物。在这里，我们开发了敏感且强大的一步法SORTER测定，以实现对PCa血浆样本中肿瘤源性外泌体中多参数miRNA的分析。因此，我们选择了几个可能与PCa相关的miRNAs来检测肿瘤源性外泌体，包括miR-21、miR-10b、miR-182、miR-222、miR-221和miR-1290。miR-21是最常用的标记，包括在PCa等各种癌症类型中过表达。miR-10b在PCa中明显表达，并促进肿瘤的增殖、迁移和侵袭。miR-182促进肿瘤细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭。miR-221和miR-222在PCa中受到调控，增加雄激素无依赖性生长。miR-1290与总体生存显著相关，并在去势抵抗性PCa的个体治疗决策中发挥作用。SORTER包括多个过程（图4A），包括外泌体识别、探针导入、荧光信号传导和扩增。为了评估SORTER的测定性能，我们选择miR-21作为模型来优化实验条件。DSN活性的最佳温度为37°C，DSN酶的最佳用量为在300μL反应体积中1 U。此外，通过将裸露的金纳米线（Au NFs）与合成的miR-21孵育，验证了SORTER系统的灵敏度，目标miRNA的检测限为约160 fM。

在优化的检测条件下，我们进一步评估了SORTER测定对肿瘤源性外泌体miR-21的分析。如图4B所示，在与Tags-Lipo@Au NFs孵育后，LNCaP Exo的荧光信号显著增加（P < 0.001）。相反，在与Tags-Lipo@Au NFs孵育后，BPH-1 Exo中几乎没有观察到信号变化，或者在与Lipo@Au NFs孵育后，BPH-1 Exo和LNCaP Exo中也几乎没有观察到信号变化。

此外，NanoFCM和TIRFM结果（图4，C和D）进一步显示，肿瘤源性的LNCaP Exo的荧光明显高于BPH-1 Exo。这些结果表明了肿瘤外泌体中miR-21的水平升高。SORTER方法的灵敏度是通过检测纯化的LNCaP Exo在PBS和健康血浆中的miR-21水平（图4E）来确定的。对添加的血浆的分析表明，与添加的PBS具有可比的分析优点，如校准灵敏度（即斜率：0.8438对0.8396）和检测限（LOD）（1.2 × 10^5 vs. 0.8 × 10^5颗粒μl^(−1）)。根据RT-qPCR定量结果，我们的检测结果显示每个LNCaP Exo含有2.565 × 10^(−2)个miR-21拷贝。相比于RT-qPCR和其他外泌体miRNA检测方法，我们具有等效灵敏度的技术或许能够绕过复杂的外泌体分离和RNA提取过程，实现快速和实用的检测肿瘤源性外泌体miRNAs。接下来，我们通过测量肿瘤源性外泌体中六种miRNA（包括miR-21、miR-222、miR-1290、miR-221、miR-10b和miR-182）在三种前列腺癌细胞（PC-3、LNCaP和DU145）和一种BPH-1源性外泌体中的表达水平来表征了SORTER的性能。如图4F所示，实验结果表明，肿瘤源性外泌体中这些miRNA的表达显著高于正常的BPH-1 Exo。我们还将RT-qPCR作为金标准，测量不同细胞源性外泌体中六种miRNA的表达水平，结果显示RT-qPCR和SORTER之间获得了0.9200的高相关系数。这种高灵敏度使我们能够直接在前列腺癌患者的血浆中检测到低水平的外泌体miR-21，这一点通过PBS空白和对照血浆的测量结果得到验证（P < 0.001；图4G）。

我们进一步使用CD63-S-L、EpCAM-S-L（5‘标记的Cy5）和Tags（5’标记的FAM）探针对前列腺癌（PCa）和前列腺增生（BPH）患者的100倍稀释血浆中的外泌体进行标记，并使用NanoFCM分析信号。我们发现在PCa组中Tags的标记效率高达4.6％，而在BPH组中标记效率低至0.2％，排除了背景中的假阳性荧光信号。此外，我们还在六个PCa和六个BPH血浆样本上进行了SORTER和RT-qPCR测量。通过SORTER，所有六种miRNA在PCa患者血浆样本中的表达水平明显高于BPH对照组。然而，这些结果显示RT-qPCR与SORTER之间的相关性明显较差（Pearson's r = 0.4911）。这种差异归因于SORTER在直接检测复杂背景中的外泌体miRNA时具有高选择性和灵敏性。RT-qPCR分析仅对miRNA标记敏感，而不对蛋白质敏感，因此容易受到非靶向miRNA的干扰，例如正常细胞源性的外泌体miRNA。为了进一步评估游离miRNA对外泌体miRNA测定的潜在干扰，我们在外泌体裂解之前对PCa血浆样本进行了SORTER分析，而在外泌体裂解后进行了DSN信号放大分析。外泌体中miR-21的荧光信号明显低于大量miR-21（P < 0.001）。这表明SORTER有效地减少了受污染的囊泡和游离miRNA的非特异性干扰。总体而言，我们的发现表明SORTER具有更优的选择性，并且不需要冗长的分离程序，这可能为在临床环境中扩展外泌体miRNA分析的应用提供潜力。

五、肿瘤源性外泌体miRNA分析SORTER的临床评价

为评估SORTER在前列腺癌（PCa）诊断中的临床应用性能，我们收集了30名患者的血浆样本，其中包括PCa（n = 20）和年龄匹配的前列腺增生（BPH）（n = 10）。我们的目标是（i）评估SORTER是否能够精确识别和分析血浆样本中的肿瘤源性外泌体，以及（ii）SORTER是否能够提高基于外泌体的液体活检的诊断性能。使用这些样本（每个血浆样本0.2 μl），我们利用SORTER测定进行多参数miRNA分析（在图5A中称为CD63+ EpCAM+ EVs）。作为比较，还在临床队列中进行了基于单一靶点（CD63或EpCAM）的miRNA分析，针对CD63+或EpCAM+ EVs进行了引导融合（图5，B和C）。

通过非监督的层次聚类分析，我们研究了每个患者的六个miRNA面板是否在不同的EV亚群中表现出互斥或相似的表达模式（图5D）。表达热图显示每个miRNA在不同的EV亚群中对于区分PCa和BPH具有相当大的异质性。在CD63+ 、EpCAM+ 和CD63+ EpCAM+ EV亚群中miRNA的异质表达谱可分为两个不同的无监督类别。相比BPH血浆样本，六个miRNA（miR-222、miR-1290、miR-182、miR-21、miR-221和miR-10b）在PCa中上调。这些比较分析揭示了重叠的EV亚群中的异质性，并证实了通过SORTER获得的分析数据的有效性。随后，在不同的EV亚群中展示了六个miRNA的成对比较（图5，E至G）。这些EV亚群中的六个miRNA在彼此之间没有强烈的相关性，这促使我们将多个标志物组合起来，以准确诊断PCa。为了探索我们的方法在PCa诊断中的能力，应用t-分布随机邻域嵌入（t-SNE）来区分PCa和BPH（图5，H至J）。与CD63+和EpCAM+ EV相比，CD63+ EpCAM+ EV在两个患者组之间显示出较小的重叠。为了进一步提高基于外泌体的液体活检在区分PCa和BPH组中的诊断性能，我们利用线性判别分析（LDA）编制了所有miRNA配置文件。通过ROC分析，我们确定了每个标志物以及在PCa签名中（由LDA加权求和的六个标志物；图5K）在灵敏度、特异性和准确性方面的表现。我们观察到没有单一标志物达到足够高的敏感性和特异性。与此同时，多参数组合提高了外泌体的分子表型诊断癌症的性能。具体来说，在CD63+ EpCAM+ EVs中的PCa标志显示出最佳的诊断性能，曲线下面积（AUC）为1.000 [95%置信区间（CI）：1.00到1.00]，相比之下，CD63+ EVs的AUC为0.820（95% CI：0.664到0.976），EpCAM+ EVs的AUC为0.970（95% CI：0.889到1.00）。此外，我们对每个标志物以及在区分BPH对照组和PCa患者方面的PCa标志的评估在图5L中展示。与CD63+ EVs（非参数、双尾曼-惠特尼U检验，P = 0.0038）和EpCAM+ EVs（P = 2.0 × 10^(-6)）相比，CD63+ EpCAM+ EVs中PCa标志的LDA分数（P = 6.7 × 10^(-8)）在PCa和BPH组之间显著不同。标志物组合的分类结果进一步呈现为混淆矩阵（图5，M至O）。在区分PCa和BPH方面，CD63+ EpCAM+ EVs中的PCa标志显示出极高的灵敏度（100%）、特异度（100%）和准确性（100%），相比之下，CD63+ EVs的灵敏度为50.0%，特异度为90.0%，准确度为76.7%，EpCAM+ EVs的灵敏度为90.0%，特异度为100%，准确度为96.7%。这些结果表明我们的SORTER能够提高基于外泌体的液体活检的诊断检测性能。

六、基于SORTER的前列腺癌的临床诊断

为了评估SORTER方法的诊断适应性，我们从参与临床队列的74名患者中收集了血浆，包括非转移性前列腺癌（nPCa，n = 27），转移性前列腺癌（mPCa，n = 20）和前列腺增生（BPH，n = 27）。其中，七个血浆样本中的四个被随机分配到训练队列。基于SORTER方法对miRNA标志物的研究首先针对训练队列进行，以生成判别函数模型，然后用该模型对验证队列中的患者进行分类。

我们首先分析了一个包括13名非转移性前列腺癌（nPCa），11名转移性前列腺癌（mPCa）和18名前列腺增生（BPH）患者的训练队列的血浆。图6A总结了训练队列中每个受试者的六种miRNA的丰度。CD63+ EpCAM+ EVs中的每种miRNA在区分前列腺癌和前列腺增生群体方面表现出相当大的异质性。使用ROC曲线分析评估了单个标志物或标志物组合的诊断指标（图6，B和C）。对于基于LDA的ROC研究，来自这个二元分类的后验概率被用作唯一的测试变量。在六个miRNA标志物中，没有一个标志物达到足够的高敏感性、特异性和准确性。包括前列腺癌标志的六个标志物的组合（1.00 AUC，100%敏感性，100%特异性和100%准确性）在训练队列中提供了比单个标志物更好的诊断能力。接下来，我们将CD63+ EpCAM+ EVs的前列腺癌标志分析与患有前列腺癌的患者的血清PSA相关联（图6D）。在训练集中，前列腺癌标志与PSA不相关（r = 0.2084；P = 0.1854）。在训练队列中，100%的前列腺增生患者（18名中的18名）显示PSA浓度增加（>4 ng ml−1，这是临床队列中使用的阈值）。相反，只有0%的前列腺癌患者（24名中的0名）具有低的前列腺癌标志值（>0.505，该阈值是基于训练队列上Youden指数获得的）。图6（E和F）描述了我们的方法对检测前列腺增生控制组和nPCa和mPCa患者两个亚组的评估。与单个标志物相比，我们观察到在疾病不同阶段存在明显增加的前列腺癌标志[Kruskal-Wallis单因素方差分析（ANOVA）分析，P = 1.6 × 10^(−8)]。为了进一步表征我们的方法区分亚组的效果，我们绘制了从判别分析计算得出的每个受试者的第一和第二个标准变量的分数（图6G）。结果可视化显示，训练样本被分类为三组，在疾病不同阶段的患者组之间有明显的分离。在训练队列中，前列腺癌标志显示出极高的敏感性（100%）、特异性（100%）和准确性（100%），能够区分前列腺癌和前列腺增生。在训练队列中，所有非转移性前列腺癌（nPCa）和转移性前列腺癌（mPCa）病例均被正确检测，实现了总体准确性达到100%（95%置信区间，100.0%至100.0%；图6H）。

SORTER方法进一步应用于由9名前列腺增生（BPH）对照、14名非转移性前列腺癌（nPCa）和9名转移性前列腺癌（mPCa）患者采集的32个年龄匹配的独立验证血浆样本集。图7A总结了每位患者所示miRNA的性能。再次分析CD63+-EpCAM+EVs中每个标志物表达的热图，显示出区分前列腺癌和前列腺增生的相当异质性。然后将验证集数据输入经过训练的LDA模型，以测试其在癌症诊断中的有效性。在验证队列中（图7，B和C），与单个标志物相比，前列腺癌标志（1.00 AUC，100%敏感性，100%特异性和100%准确性）再次显示出卓越的癌症诊断性能。我们还研究了前列腺癌标志分析与前列腺癌和前列腺增生患者血清PSA之间的相关性（图7D）。前列腺癌标志（r = 0.2018；P = 0.2681）与PSA无关。在验证队列中，88.9%的前列腺增生患者（9中的8）显示出PSA增高的浓度（>4 ng ml−1），而只有0%的前列腺癌患者（13中的0）具有低的前列腺癌标志值（>0.505）。然后，使用各种统计方法分析验证队列数据以识别前列腺癌的进展阶段。通过Kruskal-Wallis单因素方差分析和事后Dunn多重比较检验（图7，E和F），结果显示，与单个标志物相比，前列腺癌标志（P = 1.2 × 10^(−6)）在区分三个受试组时显著提高。使用由六个miRNA标志物组成的特征集的LDA图显示，在非转移性前列腺癌（nPCa）、转移性前列腺癌（mPCa）和前列腺增生（BPH）患者之间存在较小的重叠（图7G）。在验证队列中，前列腺癌标志能够以100%的灵敏度、特异性和准确性区分前列腺癌和前列腺增生。此外，仅有两个转移性前列腺癌和一个非转移性前列腺癌被错误分类，导致总体准确性为90.6%（95% CI，75.0至98.0%；图7H）。总体而言，这些比较结果进一步表明我们的SORTER方法在分子表型学和早期癌症诊断性能方面具有潜在的适应性。

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参考文献：

[1]Lei, Y, Fei, X, Ding, Y, et al. Simultaneous subset tracing and miRNA profiling of tumor-derived exosomes via dual-surface-protein orthogonal barcoding. Sci Adv. 2023; 9 (40): eadi1556. doi: 10.1126/sciadv.adi1556