V-K型CRISPR相关转座酶的靶位点选择机制

2023年11月18日《Science》发表一项研究：CRISPR 相关转座酶 (CAST) 重新利用核酸酶缺陷的 CRISPR 效应来催化 RNA 引导的大型遗传有效负载的转座。V-K型CASTs具有潜在的技术优势，但缺乏准确性，这一缺陷的分子基础一直难以捉摸。在这里，我们揭示了 V-K 型 CASTs 在依赖 RNA 整合的同时，还保持着一种不依赖 RNA 的 "脱靶 "转座途径，该途径由 TnsC 细丝的局部可用性驱动。利用冷冻电镜、单分子实验和高通量测序，我们发现一个最小的、不含 CRISPR 的转座酶体优先引导富 AT 位点的非靶向整合，而 TnsB 则赋予额外的局部特异性。利用这一知识，我们抑制了非靶向转座，并将细胞中 V-K 型 CAST 的特异性提高到 98.1%，而不影响靶向整合的效率。这些发现将为进一步改造 CAST 系统以实现精确的千碱基基因组工程应用奠定基础。