“隐隐作痛”—隐球菌脑膜炎感染病例分享
“隐隐作痛”—隐球菌脑膜炎感染病例分享
前言
隐球菌性脑膜炎（CM）是由隐球菌侵犯脑膜和（或）脑实质所导致的中枢神经系统感染，是一种机会性感染性疾病，起病隐匿，以严重的颅内压增高、脑实质损害为主要特征，常见于人类免疫缺陷病毒（HIV）感染者、器官移植受者或其他免疫抑制情况，也见于少部分免疫功能正常人群。临床上主要表现为发热、头痛、恶心、呕吐、视乳头水肿及脑神经损害等非特异性的症状和体征。本病虽患病率很低，但病情重，病死率高，且临床表现与结核性脑膜炎极为相似，故易误诊。
基本病史
患者，男，52岁。主 诉:纳差伴恶心半年，发热4天
现病史:半年前患者无明显诱因出现纳差，不思饮食，伴干呕，无反酸、烧心，无腹痛、腹泻、黑便、便血，无胸痛、胸闷等不适，间断服用中药治疗，症状反复发作；4天前无明显诱因出现发热，最高38.4℃，伴畏寒，无寒战，伴头晕、头痛，无肌肉酸痛，自行服用小柴胡治疗，效果不佳，为进一步治疗来我院就诊，门诊以“慢性胃炎，发热”收住院。患者自起病以来，神志清，精神一般，饮食差，睡眠一般，大小便未见明显异常，近期体力无明显改变，近半年体体重下降明显。
既往史:平素身体健康状况一般，否认糖尿病，否认高血压，否认冠心病，否认肝炎、结核、菌痢、伤寒等传染病史，否认外伤、手术史，否认输血、献血史，否认已知食物过敏史,预防接种史不详。
个人史:生于原籍，否认长期外地居住史，否认疫区居留史，否认特殊化学品及放射性接触史。吸烟史20余年，40支/日，戒烟半年；饮酒史20余年，平衡2次/周，4两-8两/次，未戒酒。
婚育史：适龄结婚，配偶体健，育有2子，均体健。
家族史:父亲已故，死于心脑血管疾病，母亲已故，死于胃癌，有3哥1妹，其中2哥，均死于胃癌，余体健，家族中没有传染性疾病、代谢性疾病及类似病史。
体格检查：一般生命体征平稳，神志清，精神一般，腹部平坦，腹壁未见静脉曲张，脐正常，无压痛，无反跳痛及肌紧张，肝脾肋下未触及，肠鸣音正常，双下肢无水肿。
实验室检测
图1：血常规+CRP
图2：PCT
图3：脑脊液常规
图4：脑脊液生化
图5：脑脊液培养
图6：TORCH检测IgM
图7：肺炎支原体+肺炎衣原体抗体
图8：结核效应T细胞检测
图9：淋巴细胞亚群
图10:12项细胞因子测定
图11：肿瘤标志物+呼吸道抗体
图12：G试验+GM试验
图13：免疫八项
该患者免疫八项结果HIV初筛阳性待确证。
图14：脑脊液细胞形态（墨汁染色+瑞氏染色）
墨汁染色：该方法简单易行，适合在基层医院推广。镜下可观察到特征性的“星夜现象”：即黑色背景下可见透亮的隐球菌，菌体呈圆形或卵圆形且透亮，外周有宽厚的荚膜，荚膜较菌体大1~3倍，折光性强，如同星空，可见隐球菌出芽，出芽的菌体呈葫芦状或哑铃状。
瑞氏染色：隐球菌常成堆、成簇排列，深紫红色，无核，圆形，大少不一，菌体周围有一圈宽大的荚膜，轮廓清晰可见，毛刺状，似“红毛丹”。
病例分析
隐球菌属于真菌担子菌亚门，包括30多个种，其中引起人类机会性感染的条件致病菌主要有两类：新生隐球菌 和格特隐球菌。其他种类隐球菌如罗伦隐球菌、浅白隐球菌等偶可引起人类感染。新生隐球菌在全球自然界中分布，主要存在于土壤、腐烂的蔬菜中，特别是鸽子的鸟粪中最多。而格特隐球菌主要存在于桉树中，主要分布于热带、亚热带地区。空气中的隐球菌以孢子的形式被宿主吸入肺内沉积在肺泡中。当机体免疫力功能低下或受损时，定植在宿主细胞的隐球菌大量增殖，引起隐球菌性肺炎，并经血行播散透过血—脑屏障侵犯中枢神经系统，引起隐球菌性脑膜炎。
图15： 隐球菌感染的主要途径
隐球菌性脑膜炎的诊断主要根据临床症状、体征、病理检查及实验室检查，而最后确诊有赖于各种标本直接镜检、培养或病理检查发现隐球菌。在免疫正常的宿主中，吸入的隐球菌会被有效地清除，但是在免疫功能低下的个体中，隐球菌可以增殖并播散到中枢神经系统，从而跨越血脑屏障，导致脑膜脑炎。在全球范围内，CD4+T细胞计数<100个/μl的HIV感染者隐球菌抗原阳性检出率平均为6.0%，90%的隐球菌脑膜脑炎病例见于该类人群。今年实验室遇到的三例脑脊液隐球菌感染患者均是HIV阳性。
本案例中，该患者HIV初筛阳性。入院后进行了淋巴细胞亚群分类和绝对值计数检测（图9），其中Th淋巴细胞(CD3-CD4+) 4.05%↓，CD4/CD8比值 0.07↓；淋巴细胞绝对(CD45+) 575cells/uL，B淋巴细胞绝对值 63 cells/uL↓，T淋巴细胞绝对值 375 cells/uL↓，Th淋巴细胞绝对值 63cells/uL↓，高度提示该患者免疫功能低下，是隐球菌感染的高发人群。
隐球菌培养被认为是诊断隐球菌性脑膜炎的“金标准”，超过 90%的患者培养呈阳性，当真菌负荷较低时也可能出现假阴性。在实验室，通常需要2~4d才可以看到隐球菌生长，若经抗真菌治疗，最迟可在第3周开始生长，因此诊断时效性较差。临床上更倾向于使用直接镜检（检出率相对较低，建议临床多次送检，防止漏检）及隐球菌荚膜抗原（检测来对隐球菌进行快速诊断，进而缩短疾病的诊断时间。
图14：隐球菌荚膜多糖抗原阳性
隐球菌的诊断
目前针对隐球菌感染的诊断方法有血液学、病原学、影像学、免疫学和病理学以及分子生物学等。
1 血液学检查
一般血液学检测无特异性，很难与病毒、细菌感染鉴别。血白细胞计数可正常或轻中度升高，多数在10 ×109·L-1～ 20×109·L-1之间，中性粒细胞可轻度升高，病情进展中后期可出现血红蛋白及红细胞数减少。感染指标:C反应蛋白 (CPR) 或降钙素原(PCT) 都可轻度升高，可出现血沉加快。隐球菌患者血清1, 3-β-D葡聚糖 (G试验) 常为阴性，这是由于隐球菌细胞壁中1, 3-β-D葡聚糖含量少且外层包裹很厚的荚膜多糖所导致的。而血半乳糖甘露聚糖试验(GM试验) 阳性率也很低，只有在隐球菌抗原滴度很高时，才易检出。
2 病原学涂片和培养
检测方法简单，常用于疾病筛查，标本相对容易收集。标本主要包括痰、肺泡灌洗液、胸水、血液、脑脊液和尿液等。若培养和 (或) 镜检发现隐球菌可确诊，但单次培养阳性并不能区分污染、定植和感染, 所以对怀疑隐球菌肺感染者，应反复多次多途径培养，只有多次培养阳性才有参考价值。
3 影像学
为隐球菌感染的辅助诊断方法，影像表现变化多样，且缺乏特异性，但其可作为筛查手段，也可作为病情转归的评估方法。此外，MRI可辨别隐球菌细胞壁结构，可与肿瘤相鉴别。
4 隐球菌抗原检测
抗原检测是临床诊断隐球菌病常用方法，可用于多种标本检测，其灵敏性和特异性都较高，但不能区分基因型及隐球菌种类。目前常用三种方法是：乳胶凝集试验法 (latex agglutination test，LA) 和胶体金试验法 (lateral flow assay，LFA) 以及酶联免疫吸附测定试验 (Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA) 。
5 病理学检查
病理学检查是诊断隐球菌病的金标准。典型的病理学特征为：可见小脓肿和凝固性坏死的非干酪性肉芽肿形成或形成趋势，或胶样病变。隐球菌菌体周围存在大于菌体1～3倍的荚膜，被常用各种染色方法检出：墨汁染色、苏木精-伊红 (HE) 染色 (因经验不足易导致漏诊) 、过碘酸.雪夫 (PSA) 染色、六胺银染色 (MGS) 、奥尔辛蓝 (AB) 染色和黏液卡红 (MC) 染色等。虽然病理检查是隐球菌病的金标准，但仍容易误诊或漏诊，这是与标本取材(样本较小, 取材切面等) 、真菌染色技术和病理医生对隐球菌的警惕性不够息息相关。
6 分子生物学方法
分子生物学方法包括：多重PCR检测，随机扩增多态性DNA、PCR指纹图谱分析、限制性片段长度多态性分析、扩增片段长度多态性分析和多位点序列分析。多重PCR检测临床样本的敏感度和特异度为94.8%和98.5%，目前尚无其他分子学检测方法敏感度和特异度的报道。
7 宏基因组测序
宏基因组测序是一种全面性的检测方法，已应用于临床病原体检测。宏基因组二代测序可在1次检测中准确识别几乎所有潜在的病原体（病毒、细菌、真菌和寄生虫等）。宏基因组测序为高通量测序技术，不仅可以鉴别新生隐球菌和格特隐球菌，还可以辅助鉴别隐球菌不同亚型之间病理和表型的差异，发现新的候选致病基因等等。
总结
隐球菌性脑膜炎早期明确诊断有助于临床医生及时用药控制感染症状，改善患者病情的预后。作为检验工作人员，我要重视形态学在临床应用，通过火眼金睛识别出标本中的隐形杀手，尽早明确临床诊断，进而为病人争取更多宝贵的治疗机会。
