PI3K/AKT的WB实验

我想请教一下大家，我的这个蛋白怎么会跑出双条带的，第三个条带是P-AKT，为什么跑出来是这个样子。而且，条带两边的Marker在拍片的时候也这么明显，有什么建议么，需要我去怎么调整。磷酸化蛋白我是用5%BSA做封闭液，封闭4小时，一抗1:5000，4℃过夜，二抗1:10000，室温2h，然后拍片。一抗浓度应该没问题，我从1:2000一直稀释到1:5000，然后跑出来的条带背景干净，蛋白还算清晰。