sgRNA实现细胞KO从引物设计到阳性细胞筛选-超级实用

1 背景知识介绍

1.1 sgRNA简介

短聚类规则间隔短回文重复序列(clustering regularly spaced short palindrome repeat sequence, CRISPR)是一种经过基因工程修饰的细菌适应性免疫系统，在RNA编辑的过程中引导尿苷残基插入或缺失到动质体（kinetoplastid）中，属于一种小型非编码RNA，可与pre-mRNA配对，从而实现对基因的编辑功能（可敲除基因，单碱基突变等） [1]。工程CRISPR系统由两部分组成:引导RNA (Guide RNA即gRNA或single guide, sgRNA)和CRISPR相关内核酸切酶 (Cas蛋白，一般是我们常见的Cas9) [2]。CRISPR）/CRISPR Cas9技术被认为是一种快速发展的工具，为修改靶基因序列表达和功能提供了可能性，CRISPR / Cas9工具目前正用于将用于治疗人类相关基因疾病，从遗传疾病和感染到癌症。

1.2 CRISPR-Cas9系统基本工作原理

CRISPR-Cas9系统包含一个Cas9基因及其相应的CRISPR阵列。特征性CRISPR阵列由重复序列（重复）组成，这些序列（重复序列）由来自外来遗传物质（原间隔条）的短片段的非重复序列（间隔条）隔开。靶向基本原理：CRISPR阵列被转录并加工成短的CRISPR RNA（crRNA）。crRNA和反式激活的crRNA（trans-activating crRNA, tracrRNA）形成crRNA：tracrRNA复合物，其将同源DNA序列的切割引导到适当的原间隔邻序（PAM）的上游，由crRNA- tracrRNA复合物组成的单向导RNA（sgRNA）可以掺入Cas9 / sgRNA复合物中，以在5′-NGG-3′ PAM序列之前切割其靶序列 [3-4]。

（图1 crRNA- tracrRNA复合物组成sgRNA靶向靶基因PAM启动CAS9蛋白切割原理 ）

1.3 如何提高sgRNA切割效率

众所周知，一种sgRNA通过其二级结构与体内Cas9蛋白的相互作用起作用，提示sgRNA的二级结构可能干扰编辑效率 [5，6]。因此，建立sgRNA的二级结构与编辑效率之间的联系是必要的。sgRNA包含通过人工四环连接的crRNA和tracrRNA衍生序列。crRNA序列由向导（20nt）（也称为间隔）和重复（12nt）区域组成，而tracrRNA序列由抗重复（14nt）和三个tracrRNA干环组成。重复和反重复区域（茎环RAR）触发酶RNase III的前体CRISPR RNA（pre-crRNA）处理，随后通过Cas9激活crRNA引导的DNA切割。对Cas9-sgRNA-DNA晶体结构的分析表明，茎环1（stem loop 1）对功能性Cas9-sgRNA-DNA复合物的形成至关重要，而干环2（stem loop 2）和3（stem loop 3）促进稳定的复合物形成，从而提高体内活性（如图2所示）。

（图2 sgRNA建立高效切割效率示意图 [7]）

1.4 构建sgRNA

  构建sgRNA是实现细胞/或准基因动物KO的第一步，在设计sgRNA引物时候，引物可与启动子的5′-末端和sgRNA的3′-末端配对，并含有特异性限制性内切酶位点（就是BsmBI）。靶向基因的启动子区非常重要，因为把基因的启动子消灭了，后续就无法转录更不用说翻译成蛋白了。那么问题来了， 基因启动子是一个复杂的序列，可能我们很多人都不知道基因的精确启动子区，或者核心启动子区在哪里，包括我，除非做实验去验证，并且同一物种，不同品种的启动子区可能还不一样（我相信很多博主都没讲到这一点）。

  那么如何尽可能的选择到基因的启动区进行sgRNA是比较讲技巧的，参考了一下网上的信息，首先就是在第一外内含子部分序列作为sgRNA设计的区域；此外，也能够选择已经研究清晰的，基因不同转录本中间共同内含子进行sgRNA设计，这也影响DNA转录；再者利用上述两个信息，可以设计3-4对sgRNA进而能够高效的去执行实验（一条不行，两条….对吧！！！）

  接下来就是组装sgRNA，主要是三步，首先是在sgRNA的5’端添加酶切位点（没必要加保护碱基，添加以后影响效率），其次是将sgRNA进行退火，构建双链sgRNA，最后是将sgRNA连接到已经酶切的CRISPR-Cas9质粒上（常见的又PX458/ lenti CRISPR V2）。

（图3 sgRNA基本设计原理示意图）

2 构建sgRNA实操（以PX458质粒为例）

2.1 NCBI查找XXX基因（自己感兴趣的基因）

CDS join(110..217,419..591,735..801)（sgRNA应该是包含内含子+外显子，这样子会影响转录，尤其是第一内含子和外显子，当然也能去找别人已经发表的序列，但是可能就没啥创新了，甚至是复制别人的工作。）红色标记为外显子，实在不行你们可以将这段序列copy一下，用这个序列进行练手（这个序列是我成功构建的一个例子，但是种种原因后边没有做这个基因）。

2.2 针对MIF的第一外显子/内含子和最后一个外显子/内含子（标红字母+部分非标记黑体碱基）设计sgRNA

2.2.1 设计网址（http://crispor.tefor.net/），没必要用大神张的那个网址，卡死。

打开网页如图4所示，张贴需要设计sgRNA的序列，选择对象的物种，选择对应的PAM结构（或者载体需要的结构），然后点击Submit等待即可（图5）。

（图4 打开网页界面）

（图5 sgRNA设计中….）

2.2.2 sgRNA设计结果界面

sgRNA设计结果界面，这里会讲解sgRNA靶向效率，脱靶效率等，我们就选择评分高的也就是靠前的序列，可以选一条或者两条（在这里就选择第一条进行举例说明）。点击Cloning / PCR（红框标记）。

（图6 sgRNA设计结果界面）

2.2.3 sgRNA信息

点击图6即可得到图7的sgRNA信息，图7中红框标记部分即为sgRNA的序列，复制下来，进行酶切位点的组装。其中的sense为上游引物（forward primer），antisense为下游引物（reverse primer）。

（图7 sgRNA信息）

2.2.4 sgRNA组装

我们根据PX458（Lenti CRISP v2也是这样的酶切信息，我也将其构建到Lenti CRISP v2上）的酶切位点信息进行组装，如果害怕出错，可以将复制的序列进行查找（ctrl +F），下游的查找需要反向才行。组装sgRNA(上游5’端添加CACC酶切位点；下游5’端添加AAAC酶切位点)。

组装sgRNA办法，即在5’端添加酶切位点即可（没必要添加保护碱基）

F: CACCCCGCGCTTTGTACCGTCCTC

R: AAAC GAGGACGGTACAAAGCGCGG

（建议sgRNA设计3-4条，利于高效完成，就像不要鸡蛋放在一个篮子的原来一样）

设计好的引物送引物公司设计合成即可。

2.3 寡核苷酸链引物退火

对于寡核苷酸链的退火，我一般会选择两种方式（当然不同实验室有不同办法），然后将两种退火方式获得的sgRNA混在一起构建重组质粒，目的就是高温刺激后，然后缓慢降温，是寡核苷酸链形成双链，这里也以成为体外sgRNA（small guide RNA）和体内转录后的单向道RNA（single guide RNA）不一样（见背景知识介绍）。

（NEB buffer就是BsmBI酶切用的buffer，我总体感觉NEB的产品比较好用且比较全，不过比较贵）

2.4 PX458 酶切和回收

    PX458载体需要进行酶切线性化后才能用于和退火的sgRNA进行连接，从而构建重组质粒。根据Bbs I快速酶切酶的反应条件进行加样和酶切程序设定，直接利用现成试剂盒对酶切产物进行回收，没必要跑胶（即琼脂糖凝胶电泳），跑胶以后会有大量的酶切产物损伤，要相信别人的酶的功能，现在这个技术也比较成熟了，绝大概率是不会出问题的。回收的酶切质粒使用50μL-70μL洗脱后进行分装（避免反复冻融），一般冻存在-20℃用过一年没问题，冻在-80℃更久。

(PCR仪器中孵育30min，公司建议的5-15min即可完成酶切，这里久一点也没啥问题)

2.5 PX458 + sgRNA 重组实例构建

构建重组质粒，首先是将sgRNA 连接到PX458骨架上，构建一个功能完整的质粒。一般来说质粒质量：sgRNA质量=1/3-1/10，但是我们的sgRNA太微量了，我一般使用PX458 质量为50 ng，而剩余的用双链sg RNA全补充到总体积。

（一般室温放置15分钟（可选问题不大），4℃冰箱过夜（大概12-16h），即可完成连接）

2.6 PX458 + sgRNA重组质粒转化

对于PX458质粒的转化用到的是DH5α（Lenti CRISP v2使用的超级感受态Stal3），有的公司的转化质粒也用到Stal3，所以在转化前一定要搞清楚手中的质粒需要有什么感受态来转化。

（1）从-80℃拿出感受态在冰面上融化；

（2）将转化PX458 + sgRNA重组质粒与感受态充分混匀，用枪吹打8-10次；

（3）冷激：将（2）混合物插入到冰里边冷激30min（冷激的时候将水浴锅调到42℃）；

（4）热激：将（3）混合物放到42℃水浴锅中热激60-90sec；

（5）再次冷激：将（4）混合物在冰中冷激2-5min；

（6）培养：将无抗生素培养基500μL添加到（5）中，与摇床（37℃，220rpm）作用45min-60min；

（7）离心：将（6）菌液低速离心（3000 rpm 5min-10min），收集细菌沉淀，然后用剩余的100 μL培养基重新细菌；

（8）涂板：将（7）重悬的菌液涂布至含有抗性（氨苄抗性：AmpR）的细菌培养板中；

（9）培养：将（8）含菌的板正置15-30 min， 然后导致过夜（12-16h），细菌即可形成菌落；

（10）挑取单克隆：在培养板上画“十”或“米”，在不同象限中挑取一个单克隆菌；

（11）测序：将（10）单克隆菌落在含AmpR抗性的培养基中培养4h左右即可送测序；

（12）扩培：将测序争取的菌液进行扩大培养；

（13）冻甘油和提取质粒，冻甘油菌（8:2=2菌液体积：80%甘油）

2.7 质粒提取

质粒提取根据试剂盒操作即可，这里没有什么技术含量，不再这里赘述了！

3 PX458 + sgRNA重组质粒转染细胞及阳性克隆细胞筛选

3.1 细胞转染

根据说明书执行，一般操作是:混合液1：质粒+0.75 ml opti MEM；混合液2：转染试剂+0.75 ml opti MEM；混合液3：将1 + 2 混匀，然后细胞操作台中室温放置20-30min即可。将混合液3均匀滴加到要KO的细胞培养皿中，充分混匀，转染以后没必要换液，如果要换液可根据说明书在转染后的制定时间进行换液。

3.2 阳性细胞的筛选

PX458 + sgRNA阳性细胞筛选，因PX458带有绿色荧光可以通过流式细胞仪进行筛选。在这里讲解几种筛选办法：1，流式细胞筛选，重悬细胞，进行流式筛选，我不太建议这种办法，因为这样子折腾几下，细胞都要挂了；2，手动筛选，将细胞消化重悬，倒入培养皿中，只需要少量培养基，然后将具有绿色荧光的单个细胞用枪头挑取出来，放置在96孔板中，进行单克隆培养；3，无限稀释法，将96个细胞稀释到10ml培养基中，然后种到96孔板中，每个孔一个细胞，种植完成以后，需要观察，建议每次观察十个孔，因为外边观察时间太久会导致细胞应激损伤，不立于后续培养，甚至部分细胞死了。

单克隆细胞培养，将细胞在96孔板中培养至，细胞长至80%融合率/爬满率消化，培养至48孔板中（不要想着很多，其实很多都长不起来，两个月左右能拿到结果已经是非常理想的情况），接着就是在24孔板中培养，接着12孔板培养，6孔板培养，然后提取RNA检测敲除的基因是否已经达到敲除的效果，对于有荧光但没有敲除效果的细胞可以用来做NC组，当然也能用没有进行任何操作的细胞作为NC。

4 结束。

（爱自己！！！做科研!!! 每文格言“哈佛的首任女校长说过：“教育的目标，是让人能分辨谁在胡说八道。”我们读书，不为满腹经纶，但求明辨是非，思想独立，而非成为攻讦他人的媒介”。如果有用，关注楼主GBhouse，点赞+讨论是博主持续更新的动力！！！）

[1] http://www.sgrna.org/what-does-sgrna-mean/

[2] Shojaei Baghini S, Gardanova ZR, Zekiy AO, Shomali N, Tosan F, Jarahian M. Optimizing sgRNA to Improve CRISPR/Cas9 Knockout Efficiency: Special Focus on Human and Animal Cell. Front Bioeng Biotechnol. 2021 Nov 19;9:775309. doi: 10.3389/fbioe.2021.775309.

[3] Mojica, F. J., Díez-Villaseñor, C., García-Martínez, J. & Almendros, C. Short motif sequences determine the targets of the prokaryotic CRISPR defence system. Microbiology 155, 733–740 (2009).

[4] Deltcheva, E. et al. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III. Nature 471, 602–607 (2011).

[5] Nishimasu, H. et al. Crystal structure of Cas9 in complex with guide RNA and target DNA. Cell 156, 935–949 (2014).

[6] Nishimasu, H. et al. Crystal structure of Cas9 in complex with guide RNA and target DNA. Cell 156, 935–949 (2014).

[7] Liang G, Zhang H, Lou D, Yu D. Selection of highly efficient sgRNAs for CRISPR/Cas9-based plant genome editing. Sci Rep. 2016 Feb 19;6:21451. doi: 10.1038/srep21451. PMID: 26891616; PMCID: PMC4759811.