单细胞测序丨实验设计需要做多少重复才算合适？

随着二代测序仪器升级通量不断提高，各种类型的测序技术（RNA类，DNA类），芯片以及其他组学（蛋白质组，代谢组等）已成为常见实验，此类生信文章也是层出不穷。

那么问题来了，假如课题涉及到组学内容，实验准备开展了，设计实验时遇到的第一个问题就是收集样本，需要考虑组别的设置，每组生物学重复设置，有没有必要做技术重复，取样类型，组织部位，如何进行样本的前处理，保存和送样的问题等等。

 接下来，我们就来探讨单细胞测序，怎么设置生物学重复？毕竟样本数做少了影响研究准确性，容易拒稿，样本数做多了成本hold不住。如何选择合理的样本数量，是开展单细胞研究非常关键的问题。

 生物学重复：

指对同一个处理组中独立来源的多个样本分别进行独立测定分析，是整个实验的完全重复。通俗讲就是指样本重复，比如3只小鼠，同时做一种处理，就是三个生物学重复，而三重复实验是科学研究中非常常见和重要的实验原则之一。

 为什么设置生物学重复？

（1）能够消除组内误差：生物学重复可以测量变异程度；

在实验过程中，由于各种因素的存在，单次实验结果可能受到随机误差的影响，因此仅进行单次实验无法保证其实验结果的可靠性。为了减少随机误差，通用办法是通过进行多次重复实验并取得一致的结果。

（2）增强结果的可靠性：测序的样本数越多，越能够降低背景差异；

实验数据的统计学分析往往要求基于一定数量的样本数据，否则无法适用统计检验方法相应的前提条件。统计检验中还涉及到功效的问题，功效是指在实际存在差异的情况下，能够正确地拒绝零假设的能力。较大的样本数量可以增加统计检验的功效，提高对真实效应的检测能力。同时，样本容量应足够大以确保对总体或群体进行有效的代表性推断。较大的样本容量有助于减少偶然误差的影响，并提高统计分析的可靠性。

（3）检测离群样本：异常样本的存在，会严重影响测序结果的准确性，通过计算样本间的相关性可以发现异常样本，将其排除。

随着测序价格不断下降，对多个生物重复样本的单独进行测序也逐渐成为高通量测序项目的趋势，并且许多期刊对生物学重复的个数也有明确的要求。

 单细胞测序是否需要生物学重复？

答案是至少3个，有条件越多越好，例如人的样本，由于癌症本身的复杂性和不同患者的基因差异，来自不同患者的样本并不是理论意义上的“重复”，因此为获得更具普遍性的结论，当样本来自癌症患者时，n通常大于3，甚至10+以上。而动物模型的样本也尽量保证每组3个生物学重复。

➪合适的样本量

• 样本量太大：往往会导致人力、物力和时间上的浪费；并且由于可能过分求数量，导致投入不足，质量控制下降，对研究结果造成不良影响；
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• 样本量太少：难以排除偶然的误差，出现了非真实的阴性结果，并不能代表总体。

 以下单细胞案例，为大家理清研究设计思路。

 单细胞转录组测序揭示非小细胞肺癌新辅助免疫治疗后肿瘤微环境重塑

标题：Tumor microenvironment remodeling after neoadjuvant immunotherapy in non-small cell lung cancer revealed by single-cell RNA sequencing

▌期刊名称：Genome Medicine（IF:12.3）

发表时间：2023年3月

▌研究背景

肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因，非小细胞肺癌（NSCLC）约占肺癌病例的85%。通过免疫检查点阻断（ICB）进行癌症免疫治疗是没有已识别的驱动基因突变的高级NSCLC的一线治疗，但大多数患者对免疫疗法或获得耐药性，其潜在机制仍有待探索。

▌研究设计：

总共有 39 名EGFR/ALK 突变阴性的可切除 NSCLC 初治患者参加了这项研究。

scRNA-seq队列：治疗前（n=3，活检标本）和接受新辅助PD-1抗体联合化疗治疗后非小细胞肺癌（NSCLC）患者（n=12，治疗后样本根据病理反应分为两组：主要病理反应（MPR；n = 4）和非MPR（NMPR；n = 8）。

bulk RNA-seq队列：独立治疗前患者的新鲜活检样本（n=21）

非靶向代谢组队列：在 3 个时间点收集了 24 名患者（包含9 名来自 scRNA-seq 队列患者，12 名来自独立的 RNA-seq 队列患者，3例仅捐献外周血样本的患者）的 外周血样本（n=67）

▌研究总结

1.进行了PD-1抗体联合化疗治疗前后可切除的NSCLC的单细胞转录组，并分析了整个TME的病理反应，以调查免疫系统和癌症治疗反应（图8）。

2.可切除NSCLC的scRNA-seq分析揭示了新佐剂ICB结合化疗前后TME的动态，以及良好响应者和不良响应者之间独特的TME特性。

3.在TME中确定了血清雌二醇和两种细胞类型（FCRL4+FCRL5+记忆B细胞和CD16+CX3CR1+单核细胞），它们可以作为治疗反应的生物标志物。

4.本研究捕获了高比例的中性粒细胞，揭示了免疫治疗期间的巨大异质性。

尽管受联合治疗的患者样本量受到限制，但这项研究提供了新的生物标志物来预测治疗反应，并提出了克服免疫治疗耐药性的潜在策略。

 胃腺癌进展过程中免疫和基质细胞状态和生态型的演变

标题：Evolution of immune and stromal cell states and ecotypes during gastric adenocarcinoma progression

▌期刊名称：Cancer Cell（IF:50.3）

发表时间：2023年7月

▌研究背景

胃腺癌GAC是世界上最致命的癌症之一，因其在治疗过程中往往会出现耐药性，不过从早期癌前病变到肿瘤形成和转移的机制还不大清楚，探索胃癌发展过程中不断演变的肿瘤微环境（TME），有助于揭示各种免疫抑制机制和潜在治疗靶点。以往在单细胞层面的研究工作主要集中在胃癌的肿瘤细胞上，只有少数研究工作探索了GAC的免疫微环境，而这些工作受到了样本量和分析深度的限制。

▌研究设计

scRNA-seq队列：来自43名患者的68个样本，样本覆盖了GAC发展的各个阶段，包括癌前病变（慢性萎缩性胃炎（CAG）和肠化生（IM））、原发GAC，以及腹膜、卵巢和肝脏的转移灶；部分患者的配对非肿瘤肿瘤旁组织（NAT）、正常胃组织（NGT）和外周血单核细胞（PBMCs）样本；两位健康供体的PBMCs作为对照。

▌研究总结

1.基于大量的临床样品的单细胞转录组测序结果对不同进展阶段的胃癌组织的肿瘤微环境进行了全面地描绘，揭示了6种肿瘤微环境生态型(EC1-6)与胃癌进展及生存结果的相关性；

2.广泛的间质重塑发生在GAC进展中；

3.SDC2在癌症相关成纤维细胞(CAFs)中的高表达与侵袭性表型和低存活率有关，而SDC2在CAFs中的过表达有助于肿瘤生长，提示它们可能可以作为未来的疾病治疗靶点。

单细胞要解决的首要问题是异质性问题，不做生物学重复往往只能拿到片面的细胞图谱信息，因此单细胞测序生物学重复的要求越来越高，从发表的文章中能看出，生物学重复数量通常≥3，尽管存在一些例外，但这些研究都使用了多组学/其它实验对单细胞测序得出的结论进行了补充或进一步验证。

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