求助/条带黑，蛋白反白

这次跑的磷酸化eNOS(140KDa)和Akt(56-62KDa).电泳70V40min转100V跑到底。电转湿转100V50min取出AKt和actin, eNOS再跑50min.内参用5%脱脂牛奶，目标蛋白用5%BSA封闭一小时。一抗过夜，都是santa的，稀释1:200。二抗1:5000，摇床一小时。机器自动曝光一次。结果比较震惊，主要是内参黑得看不出来，有方块形状？（图一），AKt反白（图二），eNOS非常隐晦（图三）。条带黑的问题一直没有解决，各种条件都试过了，挺焦虑的，求大神指点。