综述：DNA甲基化在肿瘤发生中的作用

DNA甲基化在肿瘤发生中的作用

正常哺乳动物基因组中的编码序列只占一小部分，在这样一个庞大的非编码DNA背景中，基因的调节显得尤为重要。哺乳动物的基因调节主要得益于其DNA上的 CpG双核苷酸中胞嘧啶5’位的甲基化，在x染色体随机失活及基因印记中，DNA甲基化也发挥了重要的作用。DNA甲基化修饰容易发生改变，是环境因素影响个体发生发展及引起肿瘤的一个可能原因，其对肿瘤发生所起的作用在近年来的研究中多有证实。

1 DNA甲基化
真核生物的DNA甲基化就是在DNA胞嘧啶的第5’位碳原子上加上甲基，催化这一过程的是DNA甲基转移酶（DNA methyl- transferase, Dnmt）。在哺乳动物基因组中，甲基化主要发生在CpG双核苷酸中胞嘧啶5’位上。CpG双核苷酸在人类基因组中的分布很不均一，其中分布较高的区域是CpG岛。在基因组中如果按照概率计算，CG二联出现的概率应是1/16，而实际情况则小得多，还不到1％。但在基因组中的某些区段（长度约300-3000bp）CpG则保持或高于正常概率，这些区段被称为CpG岛。CpG岛主要位于基因的启动子和第一外显子区域，约有60％以上的基因的启动子含有CpG岛。
CpG 岛在以下四种情况下可发生甲基化：基因印记，随机失活的女性X染色体基因，胚系特异表达基因及组织特异表达基因[1]。 基因印记是胚系早期获得的处于关闭状态的染色质和一个等位基因的高甲基化，从而导致染色体的两个等位基因具有不同的活性。人和小鼠中最典型的印记基因是父系表达的胰岛素样生长因子2 (IGF-2) 和母系表达的H19。雌性胎生哺乳类动物细胞中两条X染色体之一在发育早期随机失活，以确保其与只有一条X染色体的雄性个体内X染色体基因的剂量相同。在人类女性一条染色体上CpG 岛的高甲基化，是由于Xist基因的去甲基化后引起其它相应基因的甲基化。一旦发生X染色体失活，则该细胞有丝分裂所产生的后代都保持同一条X染色体的失活。
CpG岛甲基化谱不仅有种属特异性，而且有组织特异性。利用高效液相色谱和高效毛细管电泳分析显示5’胞嘧啶甲基化在正常人组织DNA中占总碱基的0.75-1%[2]，在正常基因组中，甲基化的胞嘧啶占3-4％。与之相比，肿瘤细胞整个基因组呈现低甲基化状态，并伴有局部区域的高甲基化。
过去二十多年中，DNA甲基化在基因调节中的作用受到广泛关注。DNA甲基化是由DNA甲基转移酶来完成修饰作用的。真核生物细胞内存在两种甲基化酶活性：一种是从头合成（de novo synthesis）甲基转移酶，如Dnmt3a 和Dnmt3b，主要是以非甲基化的DNA作为底物；另一种被称为日常型（maintenance）甲基转移酶，主要在甲基化母链（模板链）指导下使处于半甲基化的DNA双链分子上与甲基胞嘧啶相对应的胞嘧啶甲基化。 DNA甲基化可以遗传，在减数分裂和有丝分裂中作为一个遗传外标志传递给子细胞。

2 DNA甲基化与肿瘤
通过基因启动子区及附近区域CpG岛胞嘧啶的甲基化可以在转录水平调节基因的表达，从而引起相应基因沉默，去甲基化又可恢复其表达。DNA甲基化在生理情况下就参与了控制基因的时空表达，在肿瘤发生时，癌细胞全基因组低甲基化是一个重要特征。肿瘤细胞基因组甲基化的程度与正常细胞相比仅为20-60%[3] , 同时伴有局部区域基因的高甲基化,包括肿瘤抑制基因、抑制肿瘤转移和浸润的基因、细胞周期调节基因、DNA修复基因、血管形成抑制基因等。
在人类肿瘤中，P53是最易发生突变的肿瘤抑制基因。虽然有些原发肿瘤具有野生型P53，但通过P14ARF 基因甲基化沉寂后引起MDM2癌基因表达不被抑制，最终导致P53的降解 [4] 。另外，APC（adenomatous polyposis coli）基因的异常甲基化在结肠外消化肿瘤中较常见[5]，而E-cadherin启动子区的甲基化与乳腺癌和其他肿瘤的生物学特性有关[6]，细胞周期抑制基因P16ink4a 在许多原发肿瘤和细胞系中也都发生了甲基化[7]，它沉寂后不能抑制CDK4的表达而使得Rb磷酸化，其结果是癌细胞不断地增殖并逃避正常的衰老死亡机制。
hMLH1和MGMT[8]是在DNA修复信号通路中起重要作用的两个基因。hMLH1高甲基化后，碱基错配修复功能就会丧失，这常发生在结肠癌、子宫内膜癌和胃癌，可能是这些癌症发生的重要分子基础。而MGMT高甲基化引起烷基化损害无法修复，可能在结直肠癌中K-ras基因启动子序列中的G→A突变[9]起一定作用。
由于cyclin D/Rb通路的改变，细胞周期调节功能丧失，这在人类肿瘤中尤其常见，但恶性血液病中Rb的失活则较少见。P15和P16基因编码的细胞周期依赖激酶抑制子，是Rb磷酸化的上游调节因子，这两个基因在实体瘤和血液肿瘤中被证实为肿瘤抑制基因。临床诊断中有P15 甲基化的急性髓性/急性淋巴细胞性白血病（acute myelocytic /acute lyphocytic leukemia, AML/ALL）病人的血标本显示P15基因甲基化与疾病的复发，微小残留白血病有关，而非甲基化状态与疾病的形态学缓解有关。
值得注意的是甲基化在肿瘤发生中仅仅起到推波助澜的作用。遗传异常与基因修饰功能改变是肿瘤发生的两个重要机制，这一点已在许多肿瘤研究中得到证实。在AML中，44%具有P15基因甲基化的病人中都具有染色体缺失或易位，如t(8;21)(q22;q22)，t(15;17)(q22;q21)，inv(16) (p13;q22)[10]，其他染色体易位还有t(9;22)(q34;q11), t(4;11)(q21;q23), t(7;22)( p15;q23)等。这些都说明DNA甲基化异常与特异的染色体易位共同作用导致了肿瘤的发生。

3 DNA甲基化致癌机理的研究
CpG岛甲基化引起所在基因沉默的机制有以下两种：I DNA甲基化抑制基因转录的直接机制，即转录因子的结合位点内含有CpG序列，甲基化后直接影响了蛋白因子的结合活性，不能启动基因转录。II甲基化抑制转录的间接机制，即CpG甲基化，通过改变染色质的构象或与甲基化CpG结合的蛋白因子间接影响转录因子与DNA的结合。
与不含甲基化的染色质相比，甲基化后染色质对于核酸酶或限制性内切酶的敏感度下降，更容易与组蛋白H1相结合，说明甲基化与非甲基化DNA在构象上有差异。
在甲基化抑制转录的间接机制中，DNA甲基化与组蛋白去乙酰化联合，共同导致了某些基因的沉默。如DAP kinase[11]、P21(WAF1)[12]、P57KIP2[13]、环氧化酶-2[14]、P16(INK4a) 和 P14(ARF)[15]、类固醇激素受体、RARbeta2等都受到了DNA甲基化和组蛋白去乙酰化的双重调节。那么，DNA甲基化和组蛋白去乙酰化这两者之间是否存在必然联系？Nan和Jones等人研究证明MeCP2与组蛋白去乙酰化酶形成复合体[16,17]，这一复合体还包括mSin3A和其他未确定的蛋白，且在应用了组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA后转录抑制作用可被逆转。进一步的研究证明甲基化结合蛋白MeCP2结合到甲基化的DNA部位之后可募集HDAC，后者与mSin3A形成复合体起到去乙酰化的作用。国外学者通过研究发现PML-RAR癌蛋白能引起基因RARβ2的沉默，从而引起启动子区CpG岛甲基化和组蛋白去乙酰化，最终抑制了其表达，并且与早幼粒白血病发生密切相关[18]。这也是科学史上第一次找到一个癌基因引起相应基因的甲基化、组蛋白去乙酰化，从而导致基因沉默的例子。这个发现提示我们，是不是所有甲基化的发生都必需有特定蛋白质的参与，并由该蛋白召募相应的甲基化转移酶，引起启动子区的高甲基化，相应基因的表达降低，可能还与其他机制联合，如组蛋白去乙酰化等在调控胚胎发育，导致肿瘤发生中起到重要的作用。

4、结语
综上所述，DNA甲基化调节基因表达在许多方面都发挥着重要功能，它在肿瘤发生中的作用正在逐步得到阐明。目前已陆续发现许多与DNA甲基化发生相关的酶类及复合体，但是对哪些因素可引起DNA甲基化的发生，这方面的研究工作还较少。如果能够找到这些因素，不仅有助于阐明致癌机理，而且针对甲基化调节基因应用或设计药物，将为肿瘤的治疗带来广阔的前景。