NETs/NETosis | 中性粒细胞的另一重身份：与肿瘤共谋、暗中助长

你可曾听说过肿瘤中的秘密武器？他们就是肿瘤相关中性粒细胞（TANs）。这些小家伙是肿瘤微环境的重要成员，拥有着令人叹为观止的双面功能。今天，我们就来走进中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）及其形成过程（NETosis）在肿瘤世界中扮演的角色吧。

重识中性粒细胞的双面性

➤ 中性粒细胞（Neutrophil）是一类白细胞，也被称为嗜中性白细胞。它们是免疫系统中最丰富的细胞之一，占据血液中白细胞总数的大部分。

中性粒细胞具有多种重要的功能，包括参与炎症反应、吞噬病原体和死亡细胞、释放杀伤性物质等。它们通过血液循环，能够快速进入感染或炎症部位，并与其他免疫细胞协同作战，保护机体免受感染和疾病的侵袭。

➤ 肿瘤微环境（Tumor microenvironment，TME）指的是肿瘤细胞产生和生活的内环境，由肿瘤细胞、免疫细胞、血管、间质细胞等组成，对肿瘤的发生、发展、转移等过程具有重要影响。在这个微小而繁忙的世界里，肿瘤细胞与其他细胞紧密互动，相互影响。

在这其中，肿瘤相关中性粒细胞（Tumor-associated neutrophils，TANs）便是不可忽视的重要一角。肿瘤发生所产生的趋化因子能够发挥“招兵买马”的作用，募集中性粒细胞穿透血管壁进入肿瘤组织，成为TANs与其他免疫细胞协同作战发挥功能。

有趣的是，TANs拥有特工一般的多重身份。在肿瘤微环境中，TANs存在两种主要表型：抗肿瘤表型N1和促肿瘤表型N2。这两种表型在一定条件下可发生交替激活、极性互换，因此TANs表现出高度的多样性和可塑性。

N1表型TANs亚群的表面标志物为高水平的TNFα、CCL3和ICAM-1和低水平的精氨酸酶（Arginase）。而N2表型TANs亚群的特征则是趋化因子CCL2、3、4、8、12、17以及CXCL1、2、8、16的上调。

➤ 抗肿瘤表型N1 TANs的抑癌作用可依靠直接产生细胞毒性介质如活性氧（ROS）、髓过氧化物酶（MPO）等，它们可利用氧化应激效应杀伤肿瘤细胞，从而导致肿瘤细胞凋亡。

不仅如此，TANs还可以释放肿瘤坏死因子α（TNFα）、白细胞介素1b（IL-1b）、IL-6和IL-12，将肿瘤细胞引向凋亡。

在干扰素β（IFN-β）的作用下，TANs的N1表型受到抑制进而转变为N2表型。

➤ 促肿瘤表型N2 TANs的促癌作用可通过产生基质金属蛋白酶9（MMP9）、血管内皮生长因子（VEGF）、肝细胞生长因子（HGF）等细胞因子来促进肿瘤的侵袭和血管生成。

更有甚者，N2型TANs还能通过形成一种叫做"中性粒细胞胞外诱捕网（neutropil extracellular traps，NETs）"的陷阱，将循环中的肿瘤细胞一网打尽，促进肿瘤细胞的转移。虽然NETs主要作用是促进癌症的发生发展，但值得注意的是，TANs也存在抑制肿瘤细胞迁移和促进细胞死亡的情况。

中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）

NETs是经由活化的N2型TANs分泌、由DNA—蛋白质复合物组成的网状结构，其中DNA为网状结构骨架、染色质为主干，镶嵌了包括MMP9、MPO、中性粒细胞弹性酶（NE）、组织蛋白酶G在内的多种活性蛋白。

NETs的形成过程（NETosis）是一种既不同于凋亡又有别于坏死的免疫应答方式，伴有线粒体功能障碍、染色质解凝以及核膜质膜破坏。一般认为，中性粒细胞内NADPH氧化酶的激活、线粒体来源的ROS（mtROS）的产生以及线粒体通透性转换孔（mPTP）的开放促进了NETosis的诱导。该过程中可能伴随着中性粒细胞死亡，也有可能是保留无核细胞质，继续发挥炎症或消炎功能。

NETosis诱发机制示意图

doi:10.1134/S0006297920100065

接下来，对两种NETosis途径进行简要介绍：

1. 经典途径——自杀型NETosis（Suicidal NETosis）

顾名思义，自杀型NETosis意味着中性粒细胞NETs的释放伴随着中性粒细胞的死亡。在该途径中，由多种胞外刺激诱导，激活胞质中的丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和蛋白激酶C（PLC），经Raf-MEK-ERK-MAP激酶途径和PKC途径作用于下游分子进行信号放大。

MAPK的激活导致了ROS水平的快速升高，激活受体交互蛋白激酶3（RIPK3）和混合系激酶域样蛋白（MLKL），启动细胞程序性死亡；产生的ROS还作用于NE和MPO，增加核膜通透性并促进染色质的进一步展开。

与此同时，定位于核内的Ca2+依赖的肽基精氨酸脱氨酶4（PAD4）介导组蛋白修饰，导致染色体解聚。核膜的破裂由CDK4/6、网膜母细胞瘤蛋白（Rb-P）和核纤层B（lamin B）介导，从核中释放的DNA片段经NE和MPO进行加工修饰。

此外，该途径还依赖LPS激活的Caspases4/5或Caspases11，促进成孔蛋白Gasdermin D（GSDMD）引发质膜破裂，DNA—蛋白质以网状结构形式释放在胞外，最终引发中性粒细胞死亡。

Suicidal NETosis机制示意图

doi:10.3389/fimmu.2022.1075260

2.非经典途径——活力型NETosis（Vital NETosis）

活力型NETosis的特点是中性粒细胞释放NETs后仍存活，细胞核膜质膜完整并可发挥炎症功能。在该途径中，中性粒细胞受胞外刺激的影响，引发一系列响应启动NETs的形成。与自杀型NETosis不同，该途径的NETs形成过程中NOX复合物是非必需的。PAD4活化后，导致组蛋白瓜氨酸化以及染色质去凝集，DNA-蛋白质复合物包裹于囊泡中，排出到细胞外形成NETs。

Vital NETosis机制示意图

doi:10.3389/fimmu.2022.1075260

NETs在肿瘤进展中的研究

1. NETs促进胃癌血管生成

doi:10.1038/s41598-023-38755-w

➤ 胃癌是消化系统常见的恶性肿瘤，具有异质性强、难治性、预后差等特点。抗血管内皮生长因子（VEGF）疗法已应用于胃癌并显示出良好的临床效果，然而治疗后期的耐药性仍是难以避免问题。因此，必须探索抑制血管生成的新靶点并开发有效的替代疗法。

前期研究发现，胃癌组织中存在广泛的中性粒细胞浸润和NETs生成，且与胃癌的不良预后相关。此外，体外实验证明NETs可促进胃癌细胞的侵袭、转移和上皮间质转化（EMT），并刺激内皮细胞释放激活凝血途径的组织因子。

为确定确定NETs在胃癌血管生成中的作用，该研究首先通过免疫组化染色分析了胃癌患者组织样本中NETs和微血管的分布；随后建立小鼠皮下荷瘤模型观察NETs对肿瘤生长、血管生成的影响；进一步地利用蛋白质组学筛选出NETs处理人脐静脉内皮细胞（HUVEC） 中差异表达的蛋白质；体外细胞实验验证了NETs对HUVEC增殖、迁移以及小管形成的影响；应用体外大鼠主动脉培养模型，观察了NETs对HUVEC增殖、存活和趋化性的诱导作用。最终证实了NETs促进胃癌的血管生成。

文章摘要图示

2.NETs促进肝癌肺转移

doi:10.1002/ctm2.1283

➤ 肝外癌细胞转移通常扩散至肺部，肺转移是肝细胞癌（HCC）死亡的主要原因之一。肿瘤转移的发生与肿瘤微环境密切相关。肿瘤相关中性粒细胞与其他细胞以及非细胞成分共同构成了肝癌细胞的转移微环境。最新研究表明，中性粒细胞及其衍生物（NETs等）在原发肿瘤转移前生态位的形成和整个转移过程中发挥着重要作用。

已有研究证实，NETs可以通过引发促癌性炎症反应有助于肝癌细胞的早期肺转移定植。然而，肿瘤细胞如何募集中性粒细胞并影响产生NETs仍有待研究。

为了探究肝癌细胞肺转移的发生进展过程中和中性粒细胞及其NETs的作用机制，该研究首先通过生物信息学分析发现一种肝细胞释放的分泌性糖蛋白HRG与肝癌肺转移相关，生信结果在临床样本中得到验证，进一步分析发现HRG与转移微环境中的中性粒细胞有关联。通过肝癌细胞尾静脉注射构建了肺转移模型，结合体外HCC细胞实验证实了HRG可减少体内肝癌肺转移，且减少早期肺转移微环境中的中性粒细胞数量。体外实验发现HRG 通过中性粒细胞的FCγR1抑制中性粒细胞的募集和活性，并最终证实了HRG通过抑制中性粒细胞形成NETs调控肝癌肺转移。

文章摘要图示

3.NETs促进黑色素瘤转移灶癌细胞死亡

doi:10.3390/biology12060822

➤ 恶性黑色素瘤是第五大最常见的肿瘤，一旦转移就会表现出侵袭性行为。在黑色素瘤中，原发肿瘤和转移瘤中的TAN浸润均与较差的预后相关。TAN释放的NETs已在多种癌症患者的肿瘤组织和血液循环中检测到，这表明其在肿瘤免疫学中发挥着重要作用。值得注意的是，在黑色素瘤中，抑制NETosis会驱使中性粒细胞偏向于抗肿瘤表型，从而抑制黑色素瘤模型小鼠中的肿瘤生长。

该研究旨在探究 NET能否作为转移性黑色素瘤患者T细胞免疫检查点抑制之外的潜在代表靶点。首先，该研究通过测量肿瘤横截面积（CSA）评估了中性粒细胞和H3Cit浸润是否与转移灶的大小相关。进一步地，探究了中性粒细胞和NETs积累与黑色素瘤转移灶的坏死之间的相关性，结果发现转移灶大小与中性粒细胞和NETs浸润以及坏死高度相关。最终得出结论，在黑色素瘤中，中性粒细胞被募集到坏死肿瘤部位，通过NETs诱导肿瘤细胞铁死亡而导致坏死增加。

黑色素瘤转移灶中的中性粒细胞浸润情况

【参考文献】

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