动态监测肺癌患者基因变化规律及其预后意义

随着基因检测技术的普及和靶向药物的发展，靶向治疗在非小细胞肺癌（NSCLC）综合治疗中也取得显著进展，极大延长了肿瘤患者的生存时间，提高了患者的生活质量［1-2］。但由于当前肿瘤诊断水平仍相对有限，75%的患者就诊时已进展为局部晚期或发生转移，远期生存率差，总体预后不佳［3］。

肺癌患者的基因状态并非一成不变，肿瘤进展前后基因变化可能为肺癌患者的诊治提供参考。肿瘤进化过程中，不同细胞获得不同的基因变异信息并发展成不同的克隆群体［4］。在肺癌靶向治疗中，某些细胞群体由于本身具有的特定基因突变或发生新的基因突变而产生药物抵抗，成为疾病进展的重要机制，从而诱发复发、转移［5-6］。NSCLC肿瘤进展相关差异基因的发现，以及根据精确基因检测指导下的靶向药物应用，对于患者治疗方案确定、预后预测、提高生存质量和延长生存期等均具有重要意义［7-8］。本研究通过应用基因测序技术对NSCLC患者肿瘤进展前后癌症组织样本或外周血ctDNA进行肿瘤相关基因突变及基因融合状态分析，探索肿瘤进展前后基因突变规律，并初步揭示这些基因突变发生规律对患者生存获益的预测作用。

1　资料与方法

1.1　病例来源　本研究收集2007—2021年于中日友好医院中西医结合肿瘤内科及肺癌中心门诊或住院进行基因检测的NSCLC患者数据，建立肺癌基因检测数据库，记录患者基因检测的数目和结果，筛选满足纳入、排除标准的患者信息。本研究已经本院伦理委员会同意（伦理号：2018-99-K71），患者均签署知情告知书。

1.2　诊断标准　参照《中华医学会肿瘤学分会肺癌临床诊疗指南（2021版）》［9］中NSCLC的诊断标准；肿瘤分期依据国际肺癌研究协会（IASLC）第8版分期标准［10］；病理分型参照2021版WHO肺癌组织学分类标准［11］。疗效评价参照实体肿瘤疗效评价标准（RECIST）1.1版［12］。患者均为经治疗后诊断为疾病进展（PD）。

1.3　纳入、排除标准　纳入标准：（1）经病理学检查确诊为原发性NSCLC；（2）具备完整的病史资料，2次及以上组织或ctDNA分子病理检测结果；（3）经临床病理或影像学检查确定术后复发或PD；（4）患者年龄18~80岁；（5）美国东部肿瘤协作组（ECOG）患者功能状态评分（PS）为0~4分。以上各项均符合者，纳入本研究。

排除标准：（1）患者2周内接受过输血治疗；（2）患者拒绝参加临床试验。

1.4　病理及分子检测　若纳入患者存有原发手术样本，则进行常规病理复核基因检测信息，患者PD后再次行基因检测。分子检测的DNA提取包括从新鲜活检组织样本中提取基因组DNA和从外周血中抽提纯化ctDNA。组织标本采集包括患者原发或转移肿瘤组织经福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本。血液标本采集使用专业Streck BCT管，按照常规采血方式收集血液，避免血液直接冲击管壁，收集足量的外周血液样本10 mL，置于15~30 ℃环境保存。若患者在治疗周期（放疗、化疗等）内，需在患者治疗前或单次治疗2周后采血。

对于常规肺癌患者检测样本及复检可疑样本可根据实际需要进行特定基因变异的驱动基因分子检测〔至少包括表皮生长因子受体（EGFR）、间变性淋巴瘤激酶（ALK）、ROS1、RET、KRAS、PIK3CA、ERBB2、MET和BRAF基因测序〕。

1.5　临床数据收集

1.5.1　临床基线资料收集　入组时收集患者的年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤分期、手术情况、胸膜转移情况、吸烟史、家族史、肿瘤史、肺病史以及至少2次的基因检测结果。所有数据登记在病例报告表（CRF）中。吸烟史定义为至少每天吸烟1支，连续1年以上，或已戒烟不足1年者；吸烟史评估采用吸烟指数分级，吸烟指数=每天吸烟支数×吸烟年数，≤200支年为轻度吸烟，>200支年~<400支年为中度吸烟，≥400支年为重度吸烟。饮酒史定义为平均每天饮酒>1个标准饮酒量（1个标准饮酒量相当于45 mL白酒/360 mL啤酒/120 mL果酒），连续1年以上，或已戒酒不足1年者。

1.5.2　数据录入与管理　数据管理员编制数据库，利用Microsoft Excel 2019软件进行数据录入与管理。由2位数据管理员独立进行双份录入并校对，在建立的数据库确定后，由主要研究者、统计分析人员和数据管理人员对数据库进行锁定，最后分析基因检测情况，2018年12月开始分析。

1.5.3　患者随访　自患者签署知情告知书后开始随访，随访频率3个月随访1次，随访内容包括患者治疗信息、生存信息及不良事件。随访终点为患者临床死亡或研究结束，末次随访时间为2022-07-20。

1.5.4　分组　基因清除型定义［13］为基因动态监测时，由基因突变阳性结果转变为野生型无突变阴性结果，或由野生型无突变阴性结果转变为基因突变阳性结果。根据基因清除情况分为基因清除型组与非基因清除型组。

1.6　统计学方法　使用SPSS 25.0 （IBM，USA） 和GraphPad Prism 8软件进行统计分析和可视化分析。计数资料以相对数表示，组间比较采用χ2检验；计量资料以（x±s）表示，两组间比较采用成组t检验；采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，采用Log-rank检验进行生存曲线比较。以P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1　临床基线资料　共筛选入组NSCLC患者304例，最终成功随访至临床终点217例，年龄（65.1±11.6）岁；临床分期：早期（Ⅰ~Ⅱ期）48例，中晚期（Ⅲ~Ⅳ期）169例，见表1。

2.2　217例NSCLC患者基因情况　EGFR突变占67.7%（147/217），ALK突变占0.5%（1/217），无突变占29.0%（63/217）。经典突变（21 L858R和19DEL）占61.8%（134/217），其中21 L858R突变占32.3%（70/217），19DEL突变占29.5%（64/217）；非经典突变占9.2%（20/217），包括原发性T790M（0.9%，2/217）、G719X（1.4%，3/217）、20ins（0.9%，2/217）、KRAS 2（0.9%，2/217）、TP53（0.9%，2/217）等，见图1。

共纳入基因检测结果485人次（图2A），基因检测次数2次患者82.0%（178/217），3次患者12.4%（27/217），4次及以上患者5.5%（12/217）。基因检测样本来源对比如图2B所示，第1次基因检测样本包括外周血15.2%（33/217）、原发组织78.3%（170/217）、胸腔积液5.5%（12/217）、转移灶0.9%（2/217）；第2次基因检测样本包括外周血60.4%（131/217）、原发组织35.0%（76/217）、胸腔积液3.2%（7/217）、转移灶1.4%（3/217）；第3次基因检测样本包括外周血76.9%（30/39）、原发组织20.5%（8/39）、胸腔积液2.6%（1/39）；第4次基因检测样本包括外周血75.0%（9/12）、原发组织16.7%（2/12）、胸腔积液8.3%（1/12）。

2.3　PD前后NSCLC患者的基因突变结果　PD前EGFR总突变率为67.7%（147/217），EGFR基因阴性占比32.3%（70/217）；PD后EGFR总突变率为56.2%（122/217），EGFR基因阴性占比43.8%（95/217），见表2。

217例NSCLC患者进展前后基因突变分布，进展前野生型70例（32.3%），突变型（包括19DEL、21 L858R、20 T790M以及少见突变等）147例（67.7%），其中19DEL突变64例（29.5%）、21 L858R突变74例（34.1%）、20 T790M突变2例（0.9%），至少有20例（9.2%）患者为少见突变或合并少见突变；进展后野生型95例（43.8%），突变型122例（56.2%），19DEL患者67例（19.8%），21 L858R突变64例（24.0%），20 T790M突变45例（20.7%），少见突变或合并少见突变84例（38.7%），见表3。

2.4　217例NSCLC患者多次基因突变结果　首次基因检测为野生型患者（图3A）PD后再次检测结果为野生型占74.6%（47/63），发展为21 L858R突变占4.8%（3/63），发展为19DEL突变占6.3%（4/63），且19DEL突变之后可合并20 T790M突变（4.8%，3/63）。PD后少见突变占比情况：TP53占3.2%（2/63），ERBB2占3.2%（2/63）。

首次基因检测为19DEL突变患者中（图3B）PD后转化为野生型患者占48.4%（31/64），转化为21 L858R突变患者占3.1%（2/64），仍存在19DEL突变患者占46.9%（30/64）。PD后20 T790M突变占39.1%（25/64），18.8%（12/64）为20 T790M突变合19DEL突变，17.2%（11/64）为单纯20 T790M突变。PD后少见突变占比情况：TP53占9.4%（6/64），MET扩增占3.1%（2/64），PIK3CA占3.1%（2/64）。

首次基因检测为21 L858R突变患者中（图3C），PD后再次基因检测的结果显示转化为野生型患者占32.9%（23/70）；行第3次及以上检测的患者中，转化为野生型占90.0%（63/70）。进展后转化为19DEL突变患者占1.4%（1/70），仍存在21 L858R突变患者占58.6%（41/70）。进展后20 T790M突变占18.6%（13/70），14.3%（10/70）为21 L858R突变合并20 T790M突变，4.3%（3/70）为单纯20 T790M突变。进展后少见突变占比情况：TP53占8.6%（6/70），MET扩增占2.9%（2/70），EGFR扩增占2.9%（2/70），PIK3CA占2.9%（2/70）。

首次基因检测为非经典突变患者中（图3D），原发20 T790M突变占5.0%（1/20），继发20 T790M突变15.0%（3/20）。进展前后多次检测中包含21 L858R突变患者占20.0%（4/20）。EGFR基因18 G719X突变占30.0%（6/20），20 S768I突变占10.0%（2/20），20ins突变占10.0%（2/20）。其他少见突变占比情况：TP53占40.0%（8/20），KRAS占15.0%（3/20），EGFR扩增占10.0%（2/20），PIK3CA占15.0%（3/20）。

2.5　不同分组NSCLC患者的临床特征　217例NSCLC患者中基因清除型组67例，非基因清除型组150例。基因清除型组与非基因清除型组患者除肺病史（P=0.032）及靶向治疗史（P=0.001）外，其余临床特征比较，差异均无统计学意义（P>0.05），见表4。

2.6　217例基因检测NSCLC患者的基因突变结果对生存期的影响

2.6.1　基因清除型组与非基因清除型组患者无进展生存期（PFS）比较　基因清除型组与非基因清除型组中位PFS分别为9.8个月和11.8个月，差异无统计学意义〔HR=0.89，95%CI（0.66，1.20），P=0.310，图4A〕。134例晚期NSCLC患者基因清除型与非基因清除型中位PFS分别为8.1个月和9.8个月，差异无统计学意义〔HR=0.83，95%CI（0.58，1.19），P=0.359，图4B〕。

2.6.2　基因清除型与非基因清除型患者总生存期比较　基因清除型组与非基因清除型组中位总生存期（overall survival，OS）分别为50.5个月和28.5个月，差异有统计学意义〔HR=0.56，95%CI（0.41，0.78），P<0.000 1，图5A〕。134例晚期NSCLC患者基因清除型与非基因清除型中位OS分别为45.5个月和24.9个月，差异有统计学意义〔HR=0.55，95%CI（0.37，0.81），P=0.000 2，图5B〕。

3　讨论

2005年吉非替尼在国内上市标志着肺癌进入靶向治疗时代，靶向治疗显著延长了EGFR突变患者的生存期，且不良反应相对较轻，已成为晚期驱动基因阳性NSCLC患者的首选治疗方式［14］。但是目前绝大部分的EGFR-TKIs中位耐药时间在1年以内，耐药点监测以及后续耐药靶点的治疗是临床亟待解决的问题，也是目前研究热点［15-16］。精准的基因诊断是肺癌患者个体化治疗的前提，肺癌PD相关基因突变的系统研究对于肺癌基础病理、预后预测及诊疗水平的提高等均具有重要意义［17］。本研究纳入217例在PD前后进行基因检测的NSCLC患者并成功随访至临床终点，观察并探讨PD前后EGFR及伴随基因突变动态变化的特征。

本研究结果显示，对比前后基因检测结果，PD后野生型较突变型显著上升，且19DEL、21 L858R等经典突变比例下降明显；20 T790M与TP53等伴随突变比例均有所上升。20 T790M作为耐药突变，19DEL较野生型、21 L858R突变患者进展后出现20 T790M比例更高。对治疗前后是否发生基因清除患者的临床特征进行比较分析，肺病史、接受靶向治疗患者的基因清除率更高。既往研究表明化疗后突变基因下降［18］，可能由于治疗后循环肿瘤细胞释放入血比例下降，导致血液ctDNA监测结果为阴性，同时突变基因下降也间接证明治疗有效。本研究对217例NSCLC患者的PFS和OS进行随访。监测基因清除对PFS的预测效果差，总217例患者及134例晚期患者的PFS均无统计学差异；而对于OS，基因清除型NSCLC患者的OS明显更长。说明治疗前后EGFR基因突变的动态变化，预示更好的治疗效果和生存获益。可见，基因动态监测可协助预测临床治疗疗效。肿瘤分期越晚，负荷越大，因此治疗前的ctDNA水平可能越高；如果肿瘤患者对放化疗敏感，那么经过治疗，其ctDNA水平就会降低，这提示治疗是非常有效的，这部分患者也可能获得生存获益。另一方面，如果患者本身处于局部晚期，但在治疗前ctDNA即为阴性，此时的情况则更为复杂：肿瘤仍处于局限位置，ctDNA未释放到血液中或血液中ctDNA无法反映肿瘤的状态［19-20］。

本研究初步揭示基因动态监测在肺癌PD过程中的生存预测作用，发现与NSCLC生存获益密切相关的基因变化特点。联合组织样本、ctDNA样本及优化的NGS检测进行真实世界的肿瘤进展突变分析是本研究的创新之处。随着NGS技术的发展和普及，高通量测序（NGS）平台肺癌基因检测的患者比例相对有所提升。本研究数据表明肿瘤进展前后NGS检测结果对比，除了T790M、TP53等已知常见耐药突变，存在L792H等可能的潜在耐药突变，但这部分耐药基因的鉴定及治疗对策尚需进一步研究。

在NSCLC中，血浆ctDNA通常与肿瘤组织高度匹配，能很好地反映患者的肿瘤负荷，已被证实是组织检测的替代手段，有着与组织检测相当的临床指导价值［16，18］。虽然目前指南推荐优先使用肿瘤组织石蜡标本进行基因检测，但有相当一部分人不能获得组织或细胞学标本，则推荐血液ctDNA活检，以弥补肿瘤组织样本不足和不可及性［19］。另外，本研究仍存在一定的局限性，如基因检测方法差异性和样本异质性，所以未能评价特定基因突变在肺癌PD诊断治疗及预后分析中的潜在临床意义。因此，有必要进行大型队列研究，以准确确定组织和ctDNA基因检测在预后评估及预测中的价值。

综上所述，NSCLC患者PD前后基因突变状态是动态变化的。肺癌PD后患者野生型较突变型显著上升，且19DEL、21 L858R等经典突变比例明显下降；T790M与TP53等伴随突变比例均有所上升。19DEL较野生型、21 L858R突变患者进展后出现T790M突变的比例更高。监测基因清除对PFS的预测能力不足，但基因清除型可能预示更长的OS获益。在治疗过程中建议动态监测基因状态的变化，根据基因状态的改变及时调整患者的治疗方案，降低治疗的盲目性，以达到最佳临床获益。

本文无利益冲突。

参考文献略

【引用本文】　薛崇祥，鲁星妤，刘哲宁，等. 动态监测肺癌患者基因变化规律及其预后意义［J］. 中国全科医学，2023，26（36）：4527-4534. DOI：10.12114/j.issn.1007-9572.2022.0833.