恳请大佬，救救孩子吧！Min6细胞以及原代胰岛葡萄糖刺激的胰岛素分泌实验（GSIS）

主要问题：使用Min6细胞系以及原代胰岛细胞进行GSIS实验，高糖组（20mM）和低糖组（2.8mM）检测结果无差异。

实验流程：

①Min6细胞 GSIS实验

提前将细胞铺于六孔板中，细胞处于对数生长期时，开始实验

1.去除培养基，使用无糖KRBH缓冲液清洗细胞

2.孔中加入无糖/低糖（2.8mM）于孵箱中饥饿孵育1小时

3.去除上清液 ，使用无糖KRBH缓冲液清洗细胞

4.加入低糖(2mM )KRBH缓冲液 ，孵育30min，收取上清

5.加入高糖(11.1mM或20mM)KRBH缓冲液 ，孵育30min，收取上清

6.收取细胞，反复冻融+超声裂解，BCA法蛋白定量

7.上述步骤中收取的所有上清在12000r 4℃下离心15min（充分去除细胞碎片），

使用超敏Elisa insulin检测试剂盒检测上清insulin含量，根据蛋白含量均一化

②原代胰岛细胞 GSIS实验

分离胰岛细胞后，过夜稳定，挑选大小相近的20颗胰岛细胞进行实验

将胰岛细胞加入EP管中，使用掌上离心机离心（这里不敢用超速离心机，怕破坏胰岛细胞，主要目的是把胰岛离到管底，去除上清液），也是在细胞孵箱中孵育

依次加入低糖、高糖KRBH缓冲液，大致流程如Min6细胞

结果：高糖组不能有效的响应葡萄糖，增加胰岛素的分泌

恳请各位大佬指点实验中的问题，我自己考虑过是ELisa试剂盒的问题，换了俩牌子也没有解决，Buffer使用过DMEM、1640、KRBH(Krebs Ringer)，尝试了很多次，看了很多文献，没有找到关键原因，请路过的大佬可怜可怜孩子，给点指点吧o(╥﹏╥)o

底下付一些看过的protocol