求助｜细胞膜KCNH2钾离子通道的wb双条带蛋白如何跑出？

本人使用汉恒生物公司构建的pcDNA3.1-KCNH2质粒对HEK293细胞进行瞬时转染，转染48h后提取总蛋白。

使用碧云天RIPA（强）+PMSF（1:100）+蛋白酶体抑制剂（1:100）+磷酸化酶抑制剂（1:100）在冰上裂解25min，随后在超声裂解（3s超声，3s休息）。裂解后在4度14000g条件下离心25min。离心完成后加入5X loading buffer在75度条件下煮10min完成样品准备。

样品准备完成后使用6%分离胶 80mv*30min+120mv至底部完成电泳。

电泳后使用14.4甘氨酸+3.03Tris+200ml甲醇定容至1000ml，在200ma*2.5h条件下湿转。转膜后使用3%BSA+PBS封闭3h。封闭完成后使用Alomone kv11.1兔多克隆抗体（1:200，1%BSA+0.1%Tween-20+PBS稀释）在4度摇床过夜孵育。一抗孵育完成后使用PBST 洗膜10min*3次，孵育二抗，PBST 洗膜10min*3次。使用proteintech超敏ECL在伯乐显影机下显影。

经多次尝试后无法做出135 kda和155kda蛋白条带，因此向各位老师求助优化实验条件。谢谢！！（细胞膜KCNH2钾离子通道为细胞膜七跨膜蛋白，正常情况下该蛋白翻译后在内质网内形成135kda未成熟的核心糖基化蛋白，随后蛋白质转运到高尔基体糖基化形成成熟的155kda蛋白质在运至细胞膜形成功能蛋白质。故而正常情况下野生型蛋白质在wb时应见155kda+135kda条带。）

本人做出的条带和文献做出的条带对比：