快报 | 中药单体小檗胺通过ROS/Ca2+通路调节自噬促进巨噬细胞对结核分枝杆菌的清除

作者：张苏，周雪峰，欧敏，傅向东，林巧，陶晓玉，王召钦，刘爱梅，李国保，徐羽中，张国良

第一作者及单位：张苏，深圳市第三人民医院/国家感染性疾病临床医学研究中心；周雪峰，广州医科大学；欧敏，深圳市第三人民医院；傅向东，深圳市第三人民医院

通信作者及单位：徐羽中，深圳市宝安区人民医院；张国良，深圳市第三人民医院/国家感染性疾病临床医学研究中心

Berbamine promotes macrophage autophagy to clear Mycobacterium tuberculosis by regulating the ROS/Ca²⁺ axis

Zhang S, Zhou X, Ou M, Fu X, Lin Q, Tao X, Wang Z, Liu A, Li G, Xu Y, Zhang G.

mBio，2023 Jun 29:e0027223.

doi: 10.1128/mbio.00272-23. Online ahead of print.

PMID: 37382506. 

研究背景

越来越多的研究表明，传统中药在治疗疑难疾病上具有显著效果。因此，在传统中药中寻找具有良好抗结核作用，又没有明显毒性的小分子化合物作为治疗结核分枝杆菌感染的备选药物具有可行性。宿主定向治疗的出现和发展，可作为耐多药菌株引起感染的辅助疗法。其机制是通过干预宿主基因表达和功能调控宿主对结核分枝杆菌感染的免疫和炎症等应答反应，从而增强宿主对结核分枝杆菌的杀伤能力，减少细菌感染导致的炎症病理损伤，协同抗结核药物治疗的有效性，达到更好的治疗效果。目前，一些已知药物的再利用被认为是一种非常有应用前景的途径，可用于探索耐多药结核病和广泛耐药结核病菌株的新治疗方案。小檗胺（Berbamine，BBM）是从我国中草药小檗属植物中提取的一种分子量为608.71 kd的双苄基异喹啉类生物碱药物，多年来一直广泛应用于临床，具有抗炎、升白细胞、抗肿瘤等功效。近年有报道证明小檗胺具有抗新型冠状病毒的效果，关于小檗胺是否具有抗结核作用尚未见报道。

研究方法

首先，研究人员通过流式和涂板计数的方式确定了小檗胺具有促进巨噬细胞清除结核分枝杆菌的功能。接下来，研究人员探讨了小檗胺抗结核的分子机制，通过Western Blot、激光共聚焦显微成像等手段证实了小檗胺可促进结核分枝杆菌感染后巨噬细胞内自噬水平的升高，同时小檗胺还可以调节结核分枝杆菌感染后巨噬细胞内活性氧（reactive oxygen species, ROS）以及钙离子的水平。最后，研究人员还检测了小檗胺对耐药菌（异烟肼耐药菌和利福平耐药菌）的清除效果，发现小檗胺对促进巨噬细胞内耐药菌的清除具有显著作用。

研究结果

1. 小檗胺促进巨噬细胞对结核分枝杆菌的清除：我们采取人单核细胞系THP1细胞和小鼠骨髓原代巨噬细胞BMDM作为研究对象，利用本实验室的荧光菌H37Rv-GFP流式细胞术检测，发现在感染后48 h小檗胺能明显降低巨噬细胞内的结核分枝杆菌水平。涂板计数的方法检测和流式结果相同。

图1 小檗胺促进巨噬细胞对结核分枝杆菌的清除

2.小檗胺增强巨噬细胞的自噬水平：我们利用LC3稳定表达的THP1细胞进行检测，实验结果表明小檗胺可以促进胞内自噬体和自噬溶酶体的形成，和Western Blot检测结果一致，加入自噬抑制剂3-MA或者敲除自噬通路关键蛋白ATG5，均可以抑制小檗胺的效果。

图2  小檗胺增强巨噬细胞的自噬水平

3.小檗胺通过ROS/Ca²⁺轴调控自噬：通过荧光染料分别对胞浆内和线粒体的ROS和Ca²⁺染色，流式检测发现小檗胺提高胞浆和线粒体内ROS以及Ca²⁺的水平，ROS和Ca²⁺均能调控自噬。进一步利用ROS抑制剂NAC和Ca²⁺抑制剂BAPTA检测可知Ca²⁺的水平受ROS调控，反之ROS水平不受Ca²⁺的调控。因此，小檗胺通过ROS/Ca²⁺轴调控自噬。

图3 小檗胺通过ROS/Ca²⁺轴调控自噬

4. 小檗胺促进巨噬细胞对耐药结核的清除：我们利用异烟肼、利福平耐药菌株检测小檗胺对耐药菌的效果，涂板计数结果表明小檗胺可促进巨噬细胞对耐药菌的清除。

研究结论

中药单体小檗胺对巨噬细胞内结核分枝杆菌有较强的清除效果，小檗胺能明显促进巨噬细胞自噬，对自噬的调节主要依赖于活性氧（ROS）以及钙离子的水平，从而鉴定出ROS—钙离子—自噬这一重要抗结核免疫信号轴。小檗胺可作为抗结核宿主定向治疗（HDT）的候选药物，并且与目前已有的抗结核药物联用，具有提高耐药结核病治疗效果的潜能，从而为中西医结合治疗结核病提供重要理论依据。

本文来自于“中国防痨杂志期刊社”公众号