细胞疗法｜这些免疫细胞你都了解吗？又该如何实现高活性高纯度制备？

前几天，小赛在后台收到了读者提问：“想了解T细胞在体外的培养周期是多久？”在此我们也一并把答案分享给大家——原代T细胞一般在体外的培养时间不超过三周，用于功能实验的T细胞建议培养时间在14天以内。

高活性高纯度的免疫细胞制备是细胞研究治疗的关键要素，因此，在细胞构建及培养过程中我们需要了解多方面的问题。

T/CAR-T细胞制备

T细胞是机体中较重要的适应性免疫细胞之一，基于嵌合抗原受体的T细胞（CAR-T）目前在肿瘤治疗领域已取得诸多突破。赛业生物拥有丰富的T细胞制备经验，能够通过多种方法制备高纯度的T细胞，不同的制备方法可获得不同占比的CD4和CD8 T亚型细胞。我们还可提供定制化的CAR-T细胞制备服务，并且能够保证所制备CAR-T细胞的抗肿瘤功能。

● CD19 CAR-T细胞制备

图1 两种方法扩增的T细胞表型检测

图2 CD19 CAR-T细胞阳性率检测

● GPC3 CAR-T细胞制备

图3 GPC3 CAR-T细胞阳性率检测

UCAR-T细胞制备

目前上市的CAR-T细胞药物均为个体化的治疗产品，其制备成本高、周期长、制备失败风险性高、价格昂贵、难以实现产业化。因此，近年来通用型CAR-T细胞治疗的研究也越来越受到重视。T细胞用于异体治疗的障碍在于，其回输后会造成严重的移植物抗宿主反应（即GvHD）。现有的研究表明，TCR受体复合物是介导GvHD发生的重要分子，TCR复合物表达被阻断的T细胞用于异体治疗不会引起GvHD等毒副作用。基于CRISPR/Cas9技术，赛业生物建立了有效的TCRα以及CD52敲除工艺，结合慢病毒转染技术，能够制备高纯度、CAR分子高表达的通用型CAR-T细胞，可满足不同靶点研究所需要的通用型CAR-T细胞的制备。

● GPC3 UCAR-T细胞制备

图4 T细胞TCRα和CD52基因敲除细胞效率检测

图5 TCRα和CD52敲除细胞富集效率检测

图6 GPC3 UCAR-T细胞阳性率检测

NK/CAR-NK细胞制备

NK细胞是一重要的固有免疫细胞，在抗病毒感染、抗肿瘤和免疫调节方面具有重要作用。NK细胞不需要免疫预活化便可发挥免疫功能，可先于适应性免疫细胞发挥作用，且其抗肿瘤活性的发挥也不受MHC分子限制。因此，NK细胞可用于异体免疫治疗，其异体回输的安全性也在多个临床实验中被证实。赛业生物目前已建立了高纯度、高活性的NK细胞和CAR-NK细胞治疗方法，可满足研究人员在NK细胞免疫治疗以及抗体药物ADCC研究等方面的需求。

● GPC3 CAR-NK细胞制备

图7 两种NK细胞扩增方法NK细胞扩增倍数统计

图8 方法1扩增NK细胞纯度检测

图9 GPC3 CAR-NK细胞阳性率检测

CAR工具细胞制备

大规模筛选CAR分子是一项繁琐、劳动力密集、费时的工作，为了减少这一过程的工作量，通常情况下我们使用一些工具细胞来进行初步筛选工作，如Jurkat细胞、NK-92细胞、THP-1细胞等。赛业生物可提供多种CAR-工具细胞，极大加速了研究人员的项目进度。

● GPC3 CAR-Jurkat细胞构建及功能评价

图10 GPC3 CAR-Jurkat细胞构建及功能验证实验结果

（A. GPC3 CAR-Jurkat细胞阳性率检测结果，显示成功构建GPC3 CAR-Jurkat细胞；B. 肝癌细胞株表面GPC3抗原表达量检测；C. GPC3 CAR-Jurkat细胞同肝癌HepG2细胞共孵育后检测活化指标CD69以及耗竭指标PD-1和TIM-3的表达情况，显示GPC3 CAR-Jurkat细胞能够被靶细胞有效活化；D. 图C的统计结果。）