在 RNAseq 结果分析图片里，PCA 图可以用PLSDA 图替代吗？
Q：分析RNAseq结果的时候PCA分析是必须的，但是我的数据用PCA分析出来区分不是特别好，所以我就想着用有监视的PLSDA的方法来分析，效果就比较好。想问一下，文章里面可以用PLSDA的图片来替代PCA的图片吗？
A1：这个应该是可以的。发表论文时可以再拔PCA图放在supplementary中，并在结果和讨论中可以进行解释的
A2：PCA图可以用PLSDA图替代的
A3：在分析RNAseq数据时,使用PCA和PLSDA进行样本聚类分析都可以。
PCA是一种无监督的降维方法,可以展示样本间的整体变异模式。PLSDA是一种监督的分类方法,可以最大化不同组别间的变异。
一般来说,文章中会首先展示PCA结果,说明整体样本分布情况。如果PCA结果显示组别间区分不明显,则可以进一步进行PLSDA分析,以示不同组别可以被明确区分开。
在文章中,我的建议是:
1. 先呈现PCA结果,说明样本间整体变异趋势。
2. 再展示PLSDA结果,说明在监督条件下,不同组别可以被区分开。并给出PLSDA模型的参数指标,如R2X,R2Y,Q2等,以表明模型的解释能力和预测能力。
3. 同时需要讨论PCA与PLSDA结果的一致性及差异,以及PLSDA超参数选择的合理性。
4. 最终可以仅保留PLSDA结果,但需要在方法中详细描述模型建立过程,并讨论PCA结果。
所以,综合来说,PLSDA可以代替PCA用于样本区分,但需要谨慎解释,避免过度拟合,不能只展示PLSDA的优化结果。两者结合使用更好。
Q：如何验证miRna结合位点是在CDS区的？经典的miRna和靶基因的结合的位点是在3'UTR区，做双萤光素酶实验构建的载体是把3'UTR区序列克隆到萤火虫基因下游，也就是终止子后面，那如果要验证的是靶向序列在CDS区，是否也可以这么构建质粒？
A1：可以通过特异性cds序列进行结合位点验证
A2：可以用特异性cds区的引物连接上发光引物进行验证，产生特异性荧光就证明结合位点在cds区
A3：验证miRNA与靶基因CDS区结合位点的方法可以参考以下几点:
1. 如果仅验证miRNA与CDS区结合,可以将CDS区含目标位点的序列克隆到萤火虫素酶报告基因的3'UTR区,这种设计是可行的。
2. 更精确的方法是保留 CDS区在转录本中的位置,将CDS区target序列表达克隆到exon及intron区,萤火虫素酶基因作为独立的exon插入。
3. 也可以直接将整个靶基因CDS区连同上下游exon-intron序列克隆表达,保证目标位点位置和结构不变。
4. 除报告基因荧光检测外,也可以进行突变实验验证目标位点,如点突变、删除等。
5. 还需要进行miRNA过表达或抑制来验证miRNA的调控作用。
6. 最后可以进行Western blot检测靶基因蛋白水平变化,以进一步支持结论。
综上,验证CDS区位点需要保证目标序列在转录水平的位置和结构不变,荧光报告实验结合其他验证方法,可以得出较可靠的结果。
Q：请教各位大佬，我是做circRNA的相关课题，想请教一下RNase R和放线菌素D有没有必要做？还是说设计好引物做PCR检测就可以了呢？主要是这两种试剂单纯只为了验证环装的话有点太贵了
A1：在验证cirRNA的时候,RNase R处理与聚乙烯醇沉淀确实是常用的方法,但进行这两项实验可能需要一定的成本,以下是一些建议:
1. 如果仅为了验证cirRNA的环型结构,设计环内和环外引物进行PCR验证也是可以的。确保引物跨断环结点。
2. 可以只做RNase R处理实验,因为其可以降解线性RNA而不影响环型RNA,可以验证cirRNA的环形性质。
3. 不一定需要聚乙烯醇沉淀实验,该实验主要是提供cirRNA存在于细胞质而不是细胞核的证据。如果定位不是研究重点可以省略。
4. 建议做Northern blot实验,以完整band证实cirRNA的存在,该方法成本较低。
5. 如果条件允许,测序或RACE实验可以确定cirRNA的结构,但成本也较高。
6. 综合各种验证结果,即可证实cirRNA的存在。如果资源有限,可以只做RNase R处理和PCR验证。
A2：有必要，实验步骤
1.RNA 提取：
①样品处理：组织样品准备，细胞样品准备 ②RNA 提取
③总 RNA 定量
④circRNA 的预处理：去除核糖体 RNA 和 poly-A RNA
2.RNAase R 酶消化
（RNase R 是一类核糖核酸外切酶，能降解大部分线性 RNA，但 circRNA 不易被 RNase R酶消化降解。因此可以通过该实验鉴别 circRNA 和线性 RNA。）
①准备总 RNA 样品
②RNase R 反应体系
3.放线菌素 D 实验
（circRNA 半衰期一般比线性 RNA 长、稳定性更好。放线菌素 D 能抑制 RNA 的转录，可以利用放线菌素Ｄ处理细胞，检测细胞中 circRNA 和同源线性基因的含量，可反映circRNA 和线性 RNA 的半衰期和稳定性。）
4.证明成环实验：
①circRNA 高通量测序
②Northern Blot：制备尿素-丙烯酰胺变性胶；探针制备；杂交实验
③发散引物 RT-PCR
A3：设计好引物需要做一个pcr.放线菌素没有条件可以不做
A4：RNaseR和放线菌素D有条件可以做一下，没有的话设计好引物做PCR检测就可以了
Q：RNA定量酶标仪显示高参考波长检测是什么意思
A1：是指超过酶标仪特定的长度进行的检测。
A2：不一定非要选择参考波长不可。但是选择参考波长，可以消除溶血、杯子划痕、污渍等因素的干扰。主波长是针对待测物质的，随浓度变化吸光度变化。参考波长是不针对待测物质的，与待测物质浓度无关。
A3：应该是酶标仪的自我检测，检测通过就可以使用了
Q：rna干扰技术的基本原理有哪些？
A1：RNA干扰（RNA interference，RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。基因沉默，主要有转录前水平的基因沉默(TGS)和转录后水平的基因沉默(PTGS)两类：TGS是指由于DNA修饰或染色体异染色质化等原因使基因不能正常转录；PTGS是启动了细胞质内靶mRNA序列特异性的降解机制。有时转基因会同时导致TGS和PTGS。
A2：RNA干扰（RNA interference，RNAi）是通过抑制转录后水平的基因表达而诱导功能缺失表型的有力工具。由dsRNA（double-stranded RNA）引发的特定基因表达受抑制现象称为RNA干扰作用。
dsRNA（double-stranded RNA）可以介导基因沉默作用，以dsRNA为基点研究基因沉默的分子机制成为热点。dsRNA指的是大于30个碱基对的RNA分子。哺乳动物细胞有至少2条路径竞争双链RNA(dsRNA)，其一是特异性路径：特殊dsRNA的序列用于RNAi，起始阶段dsRNA被切成siRNA（small interfering RNA 或short interfering RNAs）。siRNA是RNA干扰作用赖以发生的重要中间效应分子，能提供一定的信息，允许一个特定的mRNA被降解。siRNA正义链与反义链各有21个碱基，其中19个碱基配对，再每条链的3’端都有2个不配对的碱基。
另一条是非特异性路径：只要有长的dsRNA的存在它可以降解所有的RNA，抑制所有蛋白质的合成。长的dsRNA激活蛋白激酶PKR，激活的PKR通过一系列的磷酸化关闭翻译起始因子，导致翻译抑制。也可以通过激活2’－5’AS 合成一个分子激活RNase L，导致非特异的RNA降解。
关于特异性的RNA作用机制模型，包括起始阶段和效应阶段。起始阶段dsRNA在Dicer酶（RNaseIII家族中特异识别双链RNA的一员，属内切核酸酶）的作用下加工裂解21－23核甘酸长的小分子干扰RNA片断（siRNA）。Dicer含有解旋酶活性以及dsRNA结合域和PAZ结构。
在RNAi 的效应阶段，siRNA双链结构解旋并形成有活性的蛋白/RNA复合物（RNA－induced silencing complex or RISC），在siRNA 解双链即RISC激活过程需一个ATP。由RISC中siRNA反义链与mRNA互补区域结合，随后切割mRNA从而达到在RNA水平干扰基因表达。RISC由多种蛋白成分组成，包括核酸酶，解旋酶和同源RNA链搜索活性等。
A3：RNA干扰(RNAi)技术的基本原理主要包括以下几点:
1. 引入双链RNA(dsRNA):外源性引入大小约20-25nt的小分子dsRNA。
2. Dicer酶切成siRNA:细胞内Dicer酶会识别并切割长的dsRNA,生成小的siRNA。
3. siRNA与mRNA互补结合:siRNA作为RNA诱导沉默复合体(RISC)的一部分,与目标mRNA的互补序列特异性结合。
4. mRNA降解:结合后的mRNA会被RISC内的酶如Argonaute消化降解,从而抑制基因表达。
5. 序列特异性抑制基因:不同序列的siRNA可抑制不同的目标基因,实现对特定基因的敲低。
6. shRNA持续敲低:将siRNA序列克隆到vectors中构建shRNA,可在细胞内表达并持续敲低效果。
7. miR30backbone:在miR30的前体构建backbone内可设计siRNA序列,产生人工miRNA实现RNAi。
8. CRISPR干扰:基于dCas9的CRISPRi系统可用gRNA靶向基因导致转录抑制。
综上,RNAi主要通过引入双链小分子RNA抑制同源mRNA的降解,从而实现对基因表达的靶向调控。
A4：所谓RNA干扰(RNAi)技术就是利用一小段双链RNA(dsRNA)导入人体或其他哺乳动物细胞中使特定的基因表达产生沉默。基因表达沉默的原因在于真核细胞有一种天然的防御机制能对侵入细胞的外源dsRNA产生应答激发细胞产生一种称为Dicer的RNA酶Dicer将入侵的外源dsRNA切割成22～25 bp大小的许多小片段这些小段双链RNA称为小分子干扰RNA(siRNA)。同时siRNA又诱导组装出一种称为RNA诱导沉默复合物(R=ISC)的核酸酶 RISC与siRNA结合这时细胞自身的mRNA如果含有与此小片段即siRNA同源的序列就会被降解因此引起转录该序列的基因表达表现出沉默。实际上RNAi是一种操纵基因表达、使特定基因沉默的新技术它有望用于基因治疗或基因药物的研制)。
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最后编辑于 2023-07-27 · 浏览 1728
