抗体的互补决定区与抗原决定簇是如何决定抗原-抗体结合特异性的？
Q：抗体的互补决定区与抗原决定簇是如何决定抗原-抗体结合特异性的？
A1：抗原决定簇和抗体的抗原结合位点之间以非共价键方式相互作用，二者在空间上必须处于紧密接触状态才能产生足够的结合力，分子间的互补结构决定了抗原抗体结合的特异性。其中抗原抗体分子间的相互作用即亲和力包括四种：氢键(Hydrogen bond)、离子键(lonic bond)和疏水作用(Hydrophobic interactions)以及范德华力(van der Waals interactions)。
A2：抗原和抗体的结合，实质上是抗原分子表面的抗原决定簇(表位)与抗体分子的抗原结合部位之间，在化学结构和空间构型上的互补结合，两者之间的互补程度越高，抗原与抗体之间的结合力就越强，天然抗原分子通常具有多种抗原决定簇(表位)，可刺激机体产生多种特异性抗体。而抗体的抗原结合部位由抗体分子的VH和VL上各自具有的三个超变区组成，该部位形成一个与抗原决定簇(表位)互补的沟槽，决定了抗体的特异性。不同抗体的抗原结合部位，沟槽形状不同，只有与其结构互补的抗原决定簇(表位)才能呈楔状嵌入，所以抗原与抗体的结合具有高度的特异性。
A3：抗原的特异性主要是依靠分子表面存在的特定性化学基团决定的，这些基团被称为抗原决定簇，是免疫应答以及免疫反应具有特异性的物质基础，对抗原特异性有非常重要的作用。抗原决定簇主要是存在于抗原物质表面，少部分可能存在于其内部，需经过酶处理或则是其他方式处理，才能够被暴露出来，一种抗原可同时拥有多个特定性化学基团。
抗原的特异性主要就是物质之间存在的吻合性、针对性和专一性，表现为免疫原性和反应原性，前者就是某抗原能够激发人体免疫细胞产生对应的特异性抗体和致敏淋巴细胞的能力；后者则是某特定的抗原只能和由它刺激所产生的对应抗体或致敏淋巴细胞特异性结合的能力。同时具有免疫原性和反应原性的物质称为完全抗原；只具有反应原性的物质称为半抗原。
Q：冻在液氮里的组织怎么研磨提蛋白啊，用什么工具
A1：大块的组织可以用研钵研磨，小的组织可以用1.5ml ep tube有配套的研磨棒研磨
A2：操作方法：
1：首先用研钵在低温液氮下进行预冷工作。
2：将组织放入研钵内，每次加入15ml的液氮，将组织敲碎，用棒研钵至粉末为止。
研磨要在液氮环境下操作，一定要控制在零下197℃的原因：
1：RNA容易降解，低温可以防止研磨产生热降解RNA。
2：植物细胞在低温环境下细胞壁会变得脆弱，便于细胞破碎，释放RNA。
A3：一般来说，冻存在液氮中的组织可以使用机械破碎法或化学法等方法进行蛋白提取。
机械破碎法是将组织样品在液氮中研磨成细粉末，然后加入蛋白质提取缓冲液进行破碎。常用的机械破碎方法有：
1. 手持式研钵：将组织样品放入手持式研钵中，使用研钵棒在液氮中轻轻研磨，然后加入蛋白质提取缓冲液进行破碎。
2. 球磨机：将组织样品和研磨珠放入球磨机中，使用球磨机进行研磨。
3. 超声波破碎器：将组织样品放入超声波破碎器中，使用超声波进行破碎。
化学法是利用化学试剂破坏细胞膜和细胞核，使蛋白质从细胞内溶解出来。常用的化学法有：
1. 酸性提取法：将组织样品加入酸性缓冲液中，在冰上搅拌破碎，然后离心沉淀，收集上清液即可。
2. 碱性提取法：将组织样品加入碱性缓冲液中，在冰上搅拌破碎，然后离心沉淀，收集上清液即可。
需要注意的是，在进行蛋白提取时，需要避免蛋白质的降解和氧化，因此最好在低温下进行，并添加蛋白酶抑制剂等保护剂。另外，选择合适的破碎方法和破碎时间也是影响蛋白提取效果的重要因素。
A4：研钵和研杵：将冻在液氮里的组织取出，放入研钵中，加入适量的研磨缓冲液（例如含有盐和缓冲剂的 PBS 或 Tris-HCl 缓冲液），然后使用研杵将组织研磨成细胞碎片。
超声波破碎器：超声波破碎器可以将样本通过高频率的超声波震荡和剪切破碎成细胞碎片。
Q：请问ELISA实验中，空白孔无颜色变化，而阴性对照、样本孔及阳性对照组都要颜色，后面验证时发现不加抗原直接加一抗孵育最后结果也有颜色，这个问题是出在哪一步呀
A1：可能原因有:
1. 一抗质量问题。没有经过阴性对照阻断的一抗本身就与其它成分非特异性结合,出现假阳性。
2. 洗涤不充分。操作过程中各孔间交叉污染,导致空白孔被污染。
3. 孵育条件不佳。温度或时间不当,导致非特异性结合增加。
4. 试剂配置问题。如浓缩抗体未稀释至适宜工作浓度。
5. 样本中存在干扰因素。样本本身与检测试剂非特异性结合。
A2：1可能原因：洗板不干净；解决方法：充分洗涤，彻底拍干；洗板要防止交叉污染；浓缩洗液准确配制；吸嘴尽可能一次性使用；加样或加酶拍板的滤纸应弃去不用，不要反复使用，否则易造成污染。
2)可能原因：显色液变质或者试剂过期；
解决方法：检查试剂盒有效期。
4)可能原因：试剂稀释有误，如加酶的浓度过高；
解决方法：请按说明书所示稀释倍数配制；
5)可能原因：蒸馏水受酶等污染；
解决方法：使用新鲜蒸馏水；
6可能原因：试剂混用；
解决方法：不同批号试剂勿混用。
7)可能原因：培养箱温度超过37℃或反应时间过长。
解决方法：显色反应时间适当缩短
A3：先排除阴性对照孔是否存在污染，首先考虑阴性对照存在污染所以阴性存在颜色
Q：石蜡切片在展片的时候周围的蜡展平了 但是组织总是展不平，展片温度从40℃增加到42℃还是不行，为什么石蜡切片在展片的时候组织总是展不平？
A1：要注意石蜡切片是否完全干燥，否则展开时会出现不均匀的情况；同时，在制作展片板时，要将切片放置在正中央，并避免空气泡的存在，石蜡切片的厚度影响展片效果、温度和湿度都有影响
A2：浸蜡时温度过高或时间过长,使组织硬度大于石蜡的硬度;浸蜡不足，展片时水温低，而打不开皱褶,组织碎小，块数较多，致使包埋时不易包在一个水平面上等。故浸蜡时温度一般应高于石蜡溶点2一3℃为宜。
A3：我觉得主要几个问题，组织脱水不充分，还有水分，而且分布不均。
第二个就是切片后要抓紧时间贴片，否则一会儿就卷了。
其次就是切片厚度，和切片速度。厚度太薄，速度太慢都是会卷的。
A4：石蜡切片在展片时组织难以展平的原因可能有以下几点:
1. 切片厚度不均匀。切片厚薄不一会导致热传导效率不同,薄处蜡快速融化而厚处融化缓慢,使展片不平整。
2. 组织处理不充分。组织脱水不完全、包埋不佳,都会使组织在切片中分散不均。
3. 展片温度不适宜。蜡的熔点约为56-58°C,展片温度太低无法融化蜡块,温度过高又会使组织产生收缩。适温为40-42°C。
4. 展片水质不好。水中杂质太多会影响热传导,使用蒸馏水或去离子水展片效果较好。
5. 切片捞取不平整。切片应轻柔平整地从水平面捞起,避免折曲或卷边。
6. 展片时间太短。蜡块要充分软化融化,适当延长展片时间,一般3-5分钟。
7. 切片存放不当。切片应平放于烘箱,避免倾斜、弯曲。
8. 刀片质量差。使用劣质刀片切片会造成组织断裂,展片时难以平整。
改善上述问题有助于提高石蜡切片的展片质量。也可以适当延长展片时间或稍稍提高温度,以利组织展平。
Q：检测某种抗原特异性T细胞用什么方法比较好啊？酶联免疫斑点试验还是MHC四聚体技术还是细胞内胞内细胞因子染色法啊
A1：对于检测抗原特异性T细胞,常用的主要方法有:
1. 酶联免疫斑点试验(ELISPOT):通过分泌细胞因子形成的斑点数量,反映抗原特异性T细胞的数量。操作简便,灵敏度高,定量结果好。适合检测少量样本。但无法分析细胞亚群。
2. MHC四聚体/二聚体技术:通过特异性MHC-多肽复合物识别抗原特异性T细胞。可以结合其他抗体明确细胞亚群。但需要知道特异性肽序列,操作较复杂。
3. 细胞因子染色:活化后检测细胞内细胞因子表达。可以明确细胞亚群,了解功能状态。但操作复杂,需要优化刺激条件。
4. 细胞增殖试验:通过不同抗原刺激的增殖反应分析特异性。操作相对简单,但结果较间接。
综合来说,如果仅需了解抗原特异性T细胞的数量变化,ELISPOT试验确实简便且灵敏。如果需要进一步明确细胞亚群及功能状态,建议采用MHC四聚体/二聚体技术或细胞因子染色法。还需要考虑样本数量、实验条件等选择最优方法。请参考研究目的进行方法选择。
A2：由于抗原特异性T细胞很少见，因此抗原特异性细胞检测时，希望在每个抗原特异性T细胞中分析尽可能多的参数。可以通过肽/ MHC（pMHC-多聚体直接标记特定的T细胞。但是，只能为有限数量的预定义pMHC组合生成pMHC-多聚体，尤其是对于MHC I类肽和CD8 T细胞分析。相反，用于鉴定抗原特异性CD4 T细胞的MHC II类多聚体仍不太成熟。此外，四聚体的使用仅限于复杂抗原或未充分表征的抗原，例如微生物、肿瘤或自身抗原以及人类的异质MHC背景。作为替代方案，功能测试提供了更大的灵活性，因为它们依靠自体APC刺激T细胞，而自体APC可以在生理MHC背景下处理和呈递所有类型的抗原、肽、蛋白质或粗制细胞提取物。体外抗原刺激后，将抗原诱导的T细胞反应作为间接结果进行分析，表明特定的T细胞，即增殖、活化诱导的表面或分泌的分子或细胞毒性，从而反映抗原特异性T细胞的功能和/或数量。
A3：酶联免疫斑点试验比较好一些。敏感度高一些
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最后编辑于 2023-08-09 · 浏览 1860
