protocol 分享｜DoubletFinder 去除双细胞

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简介

DoubletFinder 方法基于表达矩阵识别双细胞，将模拟的双胞与原细胞矩阵混合，进行降维聚类，根据每个细胞 k 近邻细胞中模拟双胞的比例结合 Poisson 分布进行排序、过滤。

单细胞测序期望每个单细胞反应室（GEM）里包含一个细胞或者细胞核，即每个 barcode 对应一个真实的细胞，但是单个 barcode 包含的细胞数目随着上机细胞的浓度而改变，实际数据中会有两个或多个细胞共用一个 barcode 的情况，我们称之为 doublets。Doublets 根据转录水平不同可分为两类：

Homotypic doublets: doublets derived from transcriptionally similar cells

Heterotypic doublets: doublets derived from transcriptionally distinct cells

随着细胞数增多，双细胞比例会增加。下表是 10X 平台的双细胞率，根据 Poisson 分布确定，可以参照下表计算自己的数据中双细胞的比例。

原理

DoubletFinder 方法基于表达矩阵识别双细胞，将模拟的双胞与原细胞矩阵混合，进行降维聚类，根据每个细胞 k 近邻细胞中模拟双胞的比例结合 Poisson 分布进行排序、过滤。

材料与仪器

R studio 软件

DoubletFinder R 包

GEO:GSE136103

步骤

本次复现的文章是 2019 年发表在 Nature 的文章：Resolving the fibrotic niche of human liver cirrhosis at single-cell level。选用了文章中 healthy 组小鼠的单细胞测序结果进行 doubletFinder R 包使用的演示。

安装 DoubletFinder

remotes::install_github('chris-mcginnis-ucsf/DoubletFinder')

library(DoubletFinder)

#install.packages(「Seurat」)

#install.packages('hdf5r')

#install.packages("tidyverse")

library(Seurat)

##数据预处理（cellranger 数据）##########

###

data_dir<-"/home/shpc_100670/liver/mice CCL4/raw data/GSE136103-M liver healthy"

list.files(data_dir)

GSE136103_healthy<- Read10X(data.dir = data_dir) 

dim(GSE136103_healthy)

创建 seurat 对象

#初步过滤，每个细胞中至少可检测到 200 个基因，每个基因至少在 3 个细胞表达 GSE136103_healthy <-

CreateSeuratObject(GSE136103_healthy, project = "healthy", min.cells=3, min.features=200)

GSE136103_healthy

#ncol(GSE136103_healthy1_cd45)、saveRDS(GSE136103_healthy,'GSE136103_M_healthy.rds')

##DoubletFinder############

#devtools::install_github('chris-mcginnis-ucsf/DoubletFinder')

library(DoubletFinder)

library(multtest)

if(!require(multtest))install.packages("multtest")

if(!require(Seurat))install.packages("Seurat")

if(!require(dplyr))install.packages("dplyr")

if(!require(mindr))install.packages("mindr")

if(!require(mindr))install.packages("tidyverse")

library(Seurat)

library(Rcpp)

library(harmony)

library(dplyr)

library(patchwork)

library(ggplot2)

##QC and filtering

GSE136103_healthy[["percent.mt"]] <- PercentageFeatureSet(GSE136103_healthy, pattern = "^mt-")

GSE136103_healthy<- subset(GSE136103_healthy, subset = nFeature_RNA > 300 & percent.mt < 30)

##pre-process standard workflow

GSE136103_healthy <- NormalizeData(GSE136103_healthy)

GSE136103_healthy <- FindVariableFeatures(GSE136103_healthy)

GSE136103_healthy <- ScaleData(GSE136103_healthy)

GSE136103_healthy <- RunPCA(GSE136103_healthy)

ElbowPlot(GSE136103_healthy)

GSE136103_healthy <- FindNeighbors(GSE136103_healthy, dims = 1:20)

GSE136103_healthy <- FindClusters(GSE136103_healthy)

GSE136103_healthy <- RunUMAP(GSE136103_healthy,dims = 1:20)

## pK Identification (no ground-truth)

sweep.res.list_nsclc <- paramSweep_v3(GSE136103_healthy, PCs = 1:20, sct=FALSE)

sweep.stats_nsclc <- summarizeSweep(sweep.res.list_nsclc, GT = FALSE)

bcmvn_nsclc <- find.pK(sweep.stats_nsclc)

ggplot(bcmvn_nsclc,aes(pK,BCmetric,group=1))+ 

geom_point()+ 

geom_line()

pK<-bcmvn_nsclc %>% #select the pk that corresponds to max bcmvn to optimize doublet det

filter(BCmetric==max(BCmetric))%>% 

select(pK)

pK<-as.numeric(as.character (pK[[1]]))

## Homotypic Doublet Proportion Estimate

annotations<-GSE136103_healthy@meta.data$seurat_clusters

homotypic.prop <- modelHomotypic(annotations)     

## ex: annotations <- seu_kidney@meta.data$ClusteringResults

nExp_poi <- round(0.02undefinednrow(GSE136103_healthy@meta.data))

nExp_poi.adj <- round(nExp_poundefined(1-homotypic.prop))

## Assuming 7.5% doublet formation rate - tailor for your dataset

##10000 7.6%

###9000 6.9%

###8000##7000 5.4%

##6000 4.6%

##5000 3.9%

###4000 3.1%

###3000 2.3%

## Run DoubletFinder with varying classification stringencie

GSE136103_healthy <- doubletFinder_v3(GSE136103_healthy, PCs = 1:20, pN = 0.25, pK = pK, nExp = nExp_poi.adj, reuse.pANN = FALSE,sct=FALSE)

## Plot results

View(GSE136103_healthy@meta.data)

names(GSE136103_healthy@meta.data)

DimPlot(GSE136103_healthy,reduction = 'umap',group.by = "DF.classifications_0.25_0.2_56")

###number of singlets and doublets

table(GSE136103_healthy@meta.data$DF.classifications_0.25_0.2_56)

代码运行结束。（注意代码的空格行数）

结果展示：

注意事项

1. 单细胞的 doublet 在后续分析中可能会影响细胞亚群的分型，质控时有必要去除，但预测的 doublet 不一定全都是双细胞，不同的 pipeline 分析的结果也存在差异，所以在去除 doublet 的时候需谨慎，需多个结果综合分析判断；

2. 使用 DoubletFinder 软件分析 doublets 需要注意的是，dedoublets 可能会过滤一些真正的单细胞；

3. 以上流程针对单个样本操作是没问题的，当涉及到多个单细胞样本的时候，往往需要先独立的对每个样本进行分析然后再合并。

4. DoubletFinder 需针对每一个 sample 进行单独分析，且应在 seurat 对数据进行处理前进行。

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