文献解读之单细胞测序揭示非小细胞肺癌的微环境在免疫治疗中文章

大家好，本期小编分享一篇近日，同济大学附属上海市肺科医院张鹏课题组与同济大学生命科学与技术学院王晨飞课题组与合作，于Genome Medicine 杂志在线发表题为Tumor Microenvironment Remodeling after Neoadjuvant Immunotherapy in Non-small Cell Lung Cancer Revealed by Single-Cell RNA Sequencing（单细胞RNA测序揭示非小细胞肺癌新辅助免疫治疗后肿瘤微环境重塑）的研究论文。

研究背景

肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因[1]，其中非小细胞肺癌（NSCLC）约占肺癌病例的85%[2]。通过免疫检查点阻断（ICB）进行癌症免疫治疗是晚期NSCLC的一线治疗方法，但未确定驱动基因突变[3]。

对于可切除的非小细胞肺癌，术前免疫治疗（新辅助免疫治疗）正在成为一种很有前景的治疗方案[4]。新辅助免疫治疗疗效的常用衡量标准是“主要病理反应”（MPR），其定义为治疗后常规苏木精和伊红（H&E）染色的残余活肿瘤细胞不超过10%[5]。

尽管免疫疗法有好处，但通过这种措施其疗效是有限的。新辅助抗PD-1/PD-L1免疫治疗的平均MPR率约为32%（范围18-63%）[6]。大多数患者对治疗难治或获得耐药，其潜在机制仍有待探索。

见图一

治疗期间NSCLC的scRNA-seq分析。

图一

A 整体研究设计方案。

B 根据规范标记按主要细胞类型着色的所有细胞的均匀流形近似和投影 （UMAP） 图。

C条形图表示每个患者主要细胞谱系的比例。

D 箱线图显示 TN （n = 3）、MPR （n = 4） 和 NMPR （n = 8） 患者中 T、自然杀伤 （NK）、B、骨髓细胞和中性粒细胞的细胞分数。中心线表示中位数，下铰链和上铰链分别表示第 25 个和第 75 个百分位数，晶须表示 1.5× 四分位距。每个点对应一个样本。所有调整后的P值均大于0.05。采用单侧不成对威尔科克森试验，采用FDR法调整P值。

E 分别对 TN （S3b）、MPR （P56） 和 NMPR （P20） 患者中 T （CD01）、NK （CD06） 和 B （CD07） 细胞的典型表面标志物进行免疫组织化学 （IHC） 染色的代表性图像。F 定量来自 IHC 图像的 T、NK 和 B 细胞分数。采用单侧不成对威尔科克森试验。

见图二

治疗后上皮细胞重编程。

图二

A 由簇着色的 T/NK 细胞的 UMAP 图。

B 典型 T/NK 细胞标记基因在簇中的标准化表达热图。TRM，组织驻留记忆。TN （n = 8）、MPR （n = 3） 和 NMPR （n = 4） 患者中 CD8+ T 细胞的平均细胞毒性和耗尽特征评分的 C 箱线图。中心线表示中位数、下铰链和上铰链分别表示第 25 个和第 75 个百分位数，晶须表示 1.5× 的四分位间距。采用单侧t检验。

TN （n = 3）、MPR （n = 4） 和 NMPR （n = 8） 患者中 NK 细胞的平均细胞毒性和耗尽特征评分的 D 箱线图。采用单侧t检验。

E 箱线图显示了 TN （n = 3）、MPR （n = 4） 和 NMPR （n = 8） 患者中每个 T/NK 簇的细胞分数。标明了调整后的P<0.10的所有差异。采用单侧不成对威尔科克森试验，采用FDR法调整P值。

F MPR患者癌细胞和CD16 + NK细胞之间来自CellPhoneDB的选定配体 - 受体相互作用摘要。TN （n = 3）、MPR （n = 4） 和 NMPR （n = 8） 患者 Treg 的平均用尽签名评分的 G 箱线图。采用单侧t检验。

H 由Monocle8推断的CD2 + T细胞的发育轨迹。记忆CD8+T细胞（CD8_IL7R）和效应记忆（CD8_GZMK）T细胞是分化的根源，耗尽的CD8+T细胞（CD8_HAVCR2）处于终点状态。

I 沿伪时间（下图）的记忆（CD8_IL7R）细胞中顶部差异基因的热图。TN、MPR 和 NMPR 患者在过渡期间（分为 8 个阶段：静息和激活）CD7_IL2R细胞的分布，以及伪时间（上图）。

见图三

治疗后T/NK细胞重塑。

图三

（A） 来自 14 个 IPF、985 个 COPD 和 32 个对照肺的 18，27 个内皮和间充质细胞的 UMAP，按细胞类型、疾病状态和受试者标记。在主题图中，每种颜色都由一种独特的颜色表示。虚线将VE细胞与其他基质和内皮细胞类型区分开来。

（B）表示VE细胞五种亚型特征的热图。基因表达在VE细胞中在0和1之间统一归一化。每列表示有关受试者和疾病状态的单个单元格信息，然后在上面的彩色注释栏中表示 VE 类型。每个主题都由独特的颜色表示。

（C）箱线图表示每种VE细胞类型在治疗后T/NK细胞重塑。按疾病组组织的所有VE细胞中的非零百分比组成分布。每个点代表一个受试者，胡须代表 1.5× IQR。FDR调整的Wilcoxon秩和测试结果比较IPF和控制比例报告在数据S12中。

（D）在控制远端肺，对照近端肺和远端IPF肺的受影响区域对CD31（PECAM1）和COL15A1进行IHC染色。箭头表示COL15A1染色呈阳性的血管。

（E） 来自独立数据集的远端和气道肺样本的 VE 细胞中泛 VE 标志物和 pVE 特异性标志物表达的小提琴图 （20）。

见图四

治疗后B细胞重塑。

图四

A 由簇着色的 B 单元格的 UMAP 图。

B 箱线图显示了 TN （n = 3）、MPR （n = 4） 和 NMPR （n = 8） 患者中每个 B 簇的细胞分数。中心线表示中位数、下铰链和上铰链分别表示第 25 个和第 75 个百分位数，晶须表示 1.5× 的四分位间距。标出调整后的P<0.10的所有差异。采用单侧不成对威尔科克森试验，采用FDR法调整P值。

C小提琴图，跨簇的B4_FCRL4细胞的标记基因。

D MPR 和 NMPR 肿瘤组织中B4_FCRL4细胞的原位多重免疫荧光图像。

E ICB +化疗前验证队列中B4_FCRL4签名的小提琴和箱线图（手术后9例患者被评估为MPR，12例被评估为NMPR）。采用单侧不成对威尔科克森试验。

F 晚期黑色素瘤队列中应答者 （R） 和无应答者（NR，去除 SD 患者）中B4_FCRL4签名的小提琴和箱线图。采用双侧不成对威尔科克森试验。

G Kaplan-Meier 晚期黑色素瘤队列 4 中B4_FCRL2特征的生存曲线。通过对数秩检验比较生存曲线。

H CellPhoneDB在B4_FCRL4细胞，Tfhs和CD8 + T细胞之间选定的配体 - 受体相互作用摘要。

 见图五

治疗后单核细胞重塑。

图五

A 由簇着色的骨髓细胞的 UMAP 图。

B 单核细胞/巨噬细胞标记基因在簇中的标准化表达热图。

C 定义的单核细胞簇的选定标记基因的热图。

D 单核细胞/巨噬细胞的发育轨迹由Monocle2推断。Mono_CX3CR1细胞是轨迹的根，分化成M1样（Macro_CXCL9）或M2样（Macro_SELENOP和Macro_C1QA）细胞。

E 箱线图显示了 TN （n = 3）、MPR （n = 4） 和 NMPR （n = 8） 患者中每个单核细胞簇的细胞分数。中心线表示中位数、下铰链和上铰链分别表示第 25 个和第 75 个百分位数，晶须表示 1.5× 的四分位间距。标明了与 P < 0.10 的所有差异。采用单侧不成对威尔科克森试验。

F 散点图显示 TCGA-LUAD 患者 CFP 表达水平与细胞凋亡特征之间存在显著正相关。P值采用双侧皮尔逊相关检验确定。CFP在TN（n = 3），MPR （n = 1）和NMPR（n = 3）患者中Mono_CX4CR8细胞中平均表达的G箱线图。采用单侧t检验。在ICB +化疗之前，我们的验证队列中的H小提琴和Mono_CX3CR1签名箱线图（9名患者在手术后被评估为MPR，12名患者被评估为NMPR）。采用单侧不成对威尔科克森试验。

I 晚期黑色素瘤队列中应答者 （R） 和无应答者（NR，去除 SD 患者）中Mono_CX3CR1签名的小提琴和箱线图。采用双侧不成对威尔科克森试验。黑色素瘤队列 3 中 Mono_CX1CR2 特征的 J 卡普兰-迈尔生存曲线。通过对数秩检验比较生存曲线。

K 来自 CellPhoneDB 的选定配体-受体相互作用在 MPR 患者中Mono_CX3CR1细胞、癌细胞和 NK 细胞之间的摘要。

见图六

治疗后的巨噬细胞和树突状细胞重塑。

图六

A 箱线图显示了TN（n = 3），MPR （n = 4）和NMPR（n = 8）患者中每个巨噬细胞和DC簇的细胞分数。中心线表示中位数、下铰链和上铰链分别表示第 25 个和第 75 个百分位数，晶须表示 1.5× 的四分位间距。标明了调整后的P<0.10的所有差异。采用单侧不成对威尔科克森试验，采用FDR法调整P值。

B 巨噬细胞簇中 M0、M1 和 M2 特征的模块评分热图。TN （n = 0）、MPR （n = 1） 和 NMPR （n = 2） 患者巨噬细胞的平均 M3、M4 和 M8 特征评分的 C 箱线图。采用单侧t检验。

D DC标记基因在簇间标准化表达的热图。

E Monocle2推断的DC的发展轨迹。mregDCs（DC_LAMP3）可能源自cDC1s（DC_XCR1）或cDC2s（DC_CD1C）。

F TN（n = 2，去除一个少于 10 个 DC 细胞的样本）、MPR （n = 4） 和 NMPR （n = 8） 患者 DC 的平均抗原呈递特征评分的箱线图。采用单侧t检验。

G 来自CellPhoneDB的癌细胞和cDC2s（DC_CD1C）细胞之间选定的配体 - 受体相互作用摘要。

见图七

治疗后中性粒细胞重塑。

图七

A 由簇着色的中性粒细胞的 UMAP 图。

B 中性粒细胞标记基因在簇中的标准化表达热图。NET，中性粒细胞细胞外陷阱;ISG，干扰素刺激的基因。

C 单片眼镜推断的中性粒细胞发育轨迹2。Neu_S100A12细胞是轨迹的根，分化成Neu_CCL3或Neu_IFIT3细胞。

D 二维图显示中性粒细胞沿假时间老化过程中CXCR2和CXCR4的动态表达。C xcl8 （IL8） 在 TN （n = 3）、MPR （n = 3） 和 NMPR（n = 4，去除少于 7 个Neu_CCL10个细胞的样本）患者中 Neu_CCL3 个细胞中平均表达的 E 箱线图。采用单侧t检验。

F 箱线图显示 TN （n = 3）、MPR （n = 4） 和 NMPR （n = 8） 患者中每个中性粒细胞簇的细胞分数。中心线表示中位数、下铰链和上铰链分别表示第 25 个和第 75 个百分位数，晶须表示 1.5× 的四分位间距。标明了调整后的P<0.05的所有差异。采用单侧不成对威尔科克森试验，采用FDR法调整P值。

G 热图显示驱动Neu_CCL3中性粒细胞表型的潜在配体。

H 来自CellPhoneDB的Neu_CCL3中性粒细胞和Macro_SPP1巨噬细胞之间选定的配体 - 受体相互作用的摘要。

I 散点图显示 TCGA-LUAD 患者的Neu_CCL3特征与Macro_SPP1特征之间存在显著正相关。P值采用双侧皮尔逊相关检验确定。

J 推断Neu_CCL3中性粒细胞与Macro_SPP1巨噬细胞之间的调控网络。

见图八

ICB加化疗期间NSCLC的TME动力学摘要。

图八

ICB加化疗后，免疫细胞表型重塑，正常上皮细胞在TME中扩增。效应T细胞的细胞毒性能力显著增强;但是，耗尽的标记也增加了。

记忆CD8 + T细胞被激活为效应表型。治疗增强了DC的抗原呈递功能，除这些共同特征外，主要病理应答者（MPRs）和非MPRs具有TME的不同特征。MPR中残留的癌细胞表达MHC-II分子以自身呈递肿瘤抗原，并分泌CX3CL1以募集PMos，cDC2s和CD16 + NK细胞。

PMos分泌CFP促进癌细胞凋亡。Tfhs释放CXCL13以募集CD20 + B细胞，这些B细胞聚集在TME中。来自cDC2s的IFNα和TNF推动了FCRL4 + FCRL5 +记忆B细胞的生产。FCRL4+FCRL5+记忆B细胞依次通过CD86-CD28和CD40-CD40LG相互作用激活Tfhs。

然后，活化的Tfhs分泌IL21，通过与IL21R结合来增强效应T细胞释放的GrB。这些相互作用积极促进了抗肿瘤反应。同时，MPRs抑制性Tregs和TAMs的M2特征降低。在非 MPR 中，雌激素代谢异常导致 TME 中的雌二醇升高。非MPRs的TME仍然具有抑制性，TAM的M2特征没有降低，VEGFA+单核细胞的增加和Tregs的抑制性特征。

此外，SPP1+ TAMs和CCL3+中性粒细胞相互作用促进自身扩增：SPP1+ TAM分泌SPP1和IL1B诱导CCL3+中性粒细胞的产生，CCL3+中性粒细胞依次通过CCL1和CCL3吸引SPP4+ TAM。

研究结论

可切除NSCLC的scRNA-seq分析揭示了新辅助ICB联合化疗前后TME的动态，以及良好应答者和不良应答者之间的明显TME特性。

我们在TME中鉴定了血清雌二醇和两种细胞类型（FCRL4 + FCRL5 +记忆B细胞和CD16 + CX3CR1 +单核细胞），它们可以作为治疗反应的生物标志物。此外，我们的研究捕获了高比例的中性粒细胞，揭示了免疫治疗过程中的巨大异质性。该数据集将成为癌症和中性粒细胞生物学的宝贵持续资源。

好了，今天的文献解读就到这儿来，我们下期再见！