请教用加尾法进行 microrna 的反转录和 qpcr
Q：U6内参的扩增曲线和熔解曲线都很好，但一测miR就是都不行，扩增曲线出现平台期下降，熔解曲线单峰的情况很少，几乎都是双峰或宽峰，即使少数较尖锐的单峰熔解温度也很低，75-76度左右。
有必要做NRC吗？之前做了几组NTC发现存在引物二聚体的情况，但miR的上游引物基本就是全序列了，cDNA已经稀释到100倍了，引物10μM从0.6μL降到0.4μL了，提高退火温度基本没有改善，不知道还能怎么优化了，请教一下大家
A1：首先，您提到进行了负模板对照（NTC），发现存在引物二聚体的情况。这可能会导致假阳性的信号。您已经尝试稀释cDNA和调整引物浓度，但没有看到改善。这种情况下，考虑使用非反转录控制（NRC）来评估反转录过程中的污染情况，以确定是否存在其他因素导致结果不准确。
此外，您可以尝试以下优化步骤：
1. 确保您的实验条件和PCR反应体系是正确的，包括反应缓冲液、酶的浓度、模板量等。参考相关文献或厂家推荐的实验方案进行操作。
2. 检查反应温度和退火温度的优化，可能需要尝试不同的温度梯度。
3. 检查引物的设计和序列，确保引物与目标microRNA的互补性良好，并且没有二聚体倾向。
4. 考虑尝试其他反转录和扩增方法，例如使用不同的反转录酶或qPCR引物。
Q：请问，想用RNAi达到提高死亡率的效果，在干扰片段设计的时候，片段包含保守结构域，干扰效果会增强嘛？
A1：是的，这样其干扰效果就会增强。
A2：保守结构域对干扰效果有一定增强，但是要适量，过多保守域会影响干扰效果
A3：RNA干扰（RNAi）是一种通过抑制特定基因表达来实现功能研究或治疗的方法。干扰片段的设计对于RNAi的效果至关重要。包含保守结构域的干扰片段可能会增强RNAi的效果。保守结构域指的是在物种间高度保守的RNA序列或结构区域，其功能通常与基因的正常功能密切相关。通过干扰保守结构域，可以选择性地干扰目标基因，从而增强RNAi的效果。不过，干扰片段的设计还涉及其他因素，如选择适当的目标序列和优化片段的化学性质，这些因素也需要考虑以获得最佳的干扰效果。
Q：包涵体在离心时在上清还是沉淀部分？还是都有？
A1：包涵体离心后大部分都是在沉淀部分
A2：包涵体在离心时主要存在于以下几种情况:
1. 大部分包涵体会沉淀在离心管的沉淀部分。因为包涵体的密度一般大于上清液,在离心力作用下会迁移到管底部形成沉淀。
2. 也有一小部分包涵体可能悬浮在上清液中。这些包涵体的密度较小,或者包涵体颗粒较小,无法有效沉淀。
3. 如果包涵体与上清液的密度非常接近,则可能难以通过一次离心完全沉淀。这时包涵体会有一部分残留在上清液中。
4. 若离心条件不恰当,速度过快或者时间过短,也可能导致包涵体沉淀不完全,一定量悬浮在上清液中。
综上所述,包涵体离心后主要存在于沉淀部分,但根据包涵体本身性质和离心条件的不同,一小部分也可能悬浮在上清液中。需要优化离心条件,使包涵体尽量沉淀在管底。也可以多次离心以提高回收率。
Q：我用TSS法制备rosetta感受态，但是我配的1*TSS的PH调过了，我又用盐酸回调到6.5，请问是否会对感受态制备有影响？
A1：在其他没有影响的情况下，PH调回到6.5时对感受态制备没有什么影响。
A2：在制备Rosetta感受态时，pH值的调整对结果可能会产生影响。pH的改变可以影响蛋白质的结构和稳定性，进而影响感受态的形成。您使用盐酸将pH回调到6.5，这是一个较为中性的条件，可能有助于维持蛋白质的稳定性。然而，具体的影响还需要考虑其他实验参数和具体的蛋白质系统。
Q：求问一下hep3B细胞表达cccDNA和pg吗，检测了好几次都没检测到
A1：一般来说hep3B细胞不会表达cccDNA和pg。
A2：Hep3B细胞一般情况下不会表达C-C chemokine receptor type D (CCR4)蛋白和prostaglandin G/H synthase (PG)蛋白。然而，这仍然取决于实验条件和检测方法的选择。
如果您在Hep3B细胞中进行了CCR4或PG蛋白的表达试验，但没有检测到目标蛋白，可能有以下几个可能的原因：
1. 转染效率低：确保您使用的转染方法和载体选择适合Hep3B细胞，并且转染效率足够高。选择合适的转染试剂和优化转染条件，以提高转染效率。
2. 检测方法问题：检查您使用的抗体是否特异性良好，并且已经在其他细胞类型或组织中验证过。可能需要尝试不同的抗体，或者使用其他检测方法（例如免疫荧光染色、Western blot等）来确认蛋白的表达。
3. 表达时间点问题：确保您选择适当的时间点来检测蛋白表达。不同基因的表达动力学可能存在差异，可能需要在适当的时间点进行检测。
4. 细胞特异性问题：在进行实验之前，最好对CCR4和PG在Hep3B细胞中的表达进行文献调研，了解是否已经有相关研究报告表明在Hep3B细胞中有CCR4或PG的表达。
最后编辑于 2023-07-13 · 浏览 988
