protocol 分享｜SPSS 分析 qPCR 数据
简介
qPCR 是一种相对表达定量的方法，real-time qPCR 就是在 PCR 扩增过程中，通过荧光信号，对 PCR 进程进行实时检测。Real-time qPCR 因为其灵活的操作性、良好重复性等优点发展迅速。SPSS (Statistical Product and Service Solutions) 是一个组合式软件包，它集数据录入、整理、分析功能于一身。
2010 年被 IBM 并购 SPSS 统一更名为 IBM SPSS，每年 8 月更新版本。目前最新版本为 SPSS Statistics 29。
原理
由于在 PCR 扩增的指数时期，模板的 Ct 值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以该 Ct 值成为实验定量的依据。
用途
qPCR 用于差异基因表达、SNP 检测、药物研发、临床诊断等。SPSS 用于市场研究、健康研究调查、政府、教育研究、营销组织、数据挖掘等。
材料与仪器
spss 软件/网页版，qPCR 数据文件
步骤
1、认识 SPSS 软件界面
SPSS 界面和普通 EXCEL 界面相似，横向可设置变量种类，纵向为具体变量数据。点击下面标签可以转换到变量视图，设置变量类型。我们直接在这个界面输入数据就行。
2、数据导入
方法一：标准导入
点击：文件-打开-数据，在对话框选择你所要导入的数据文件即可。
方法二、拖拽导入
直接将数据 Excel 文件拖入 SPSS 操作页面，数据拖入后会出现如下界面，点确定即可。
3、描述性统计分析
对数据的均值、方差、标准差等进行计算分析。
点击：文件-分析-描述性统计-频率-勾选所需统计量
4、q-PCR 数据统计：比较 Ct 方法（2-△△Ct）
首先保证数据准确，遵守 MIQE 标准 1。下面以每组 3 个重复样本量为例说明如何统计分析。
该数据为两组，每组 3 个 PCR 数据。首先测出目的基因变化量（目的基因量和其对应的内参基因之比，也就是 2-△Ct），对照组同理。然后将实验组（experimental）的平均值与对照组的 2-△Ct 相比，即可得到 2-△△Ct ，也就是倍数变化（fold change）。
5、选择正确统计方法，进行差异性统计
（1）t 检验是用来根据两组数据的平均值的差异来计算 p 值的。t 检验的主要假设是，两组数据是独立的，并且符合正态分布。t 检验与非参数检验相比，是最著名的非参数统计检验之一；
（2）Wilcoxon 秩和检验（有时称为 Mann-Whitney U 检验；不要与 Wilcoxon signed-rank 检验混淆，后者用于比较两个配对组）。与参数统计检验（如 t 检验）相比，有一个优势，即它们不依赖于数据是否正态分布；
（3）正态分布的 Kolmogorov-Smirnov 检验可以用来决定是应用 t 检验还是非参数检验。
6、p 值分析
通常我们鼓励将 p 的具体绝对值体现在表格中，因为 p_会隐藏 p 的绝对值。而呈现真正绝对值的时候，0.032 的 p 值比 0.055 的 p 值稍有 "意义"。
注意事项
1. 变量类型设置错误。如将定性变量设置为定量变量。解决方法是根据变量的本质判断其类型，定性与定量变量要区分清楚。
2. 统计方法选择错误。没有根据数据类型和数据分布特点选择合理的统计检验方法，或是对各种参数检验背后的原理与假设没有正确理解，这会使得检验结果不合理，从而产生错误的统计推断。解决方法是系统性学习各统计检验方法的理论知识并学会正确判断选择。
3. 对 p 值的误解。将 p 值的大小本身视为组间差异或相关的大小，比如认为 p<0.01 的数据比 p<0.05 的数据组间差异更大，这个理解是错误的！这两个 p 值比较，只能得出组间差异有统计学差异，或者说前者出错的概率更低，而将 p 值高低进行比较会对 p 值产生理解误区，继而产生错误判断。解决方法是正确理解 p 值代表的检验结果的可信度或显著性水平。
4. PCR 多次实验重复后，标准曲线重合度小，实验重复性差？
（1）基线设置太低影响精确度和准确度。解决方法是手动设置基线，基线终止值（End）设置在信号上升之前。
（2）加样误差，比如制备 PCR 反应液时没有完全混匀，导致加样时每个孔成分不同。解决方法是在分装反应液之前，要将反应液充分混匀（振荡，吹打）。同时上机之前，要将 PCR 管或者 PCR 板离心，使所有的液体都在反应管底部。
（3）低拷贝的样品，泊松分布
若 A 管（30 μL）中有 9 个模板，则均匀分配 10 μL 到 B、C、D 管中时，每管 3 个模板的概率不相同。这个误差没有很好的解决办法。
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最后编辑于 2023-07-12 · 浏览 2267
