ChIP IP 时需要定量吗？
Q：ChIP IP时需要定量吗？
A1：是的，ChIP IP时需要进行定量。
A2：如果后续涉及到蛋白质实验的话，建议chip ip进行定量检测，方便后续实验进行
A3：在ChIP-IP（染色质免疫共沉淀）实验中，定量是非常重要的步骤之一。定量可以帮助确定与特定染色质修饰或转录因子结合的DNA片段的丰度，从而评估它们在样品中的相对丰度和变化。这对于研究基因调控、染色质结构和转录调控等方面非常有用。
定量的方法可以根据实验目的和可用技术进行选择。一种常用的方法是实时定量聚合酶链式反应（qPCR），通过测量特定DNA片段的放大产物数量来估计其在免疫共沉淀中的富集程度。另一种方法是使用高通量测序技术，如ChIP-seq，可以对整个基因组范围的DNA片段进行定量，从而获得更全面的信息。
通过定量分析，可以比较不同条件下的富集程度、不同组间的差异、不同位点之间的差异等。这有助于解释基因调控的机制、鉴定重要的转录因子结合位点以及发现新的染色质修饰模式。
因此，定量在ChIP-IP实验中是非常重要的，可以提供定量数据来支持实验结果的解释和分析。
Q：通过高效液相色谱法同时测定红景天苷、绿原酸、齐墩果酸混合对照品溶液时，色谱条件是如何的？流动相洗脱条件是怎样？
A1：色谱柱:Diamonsil C18(5 μm,250×0.46 mm);流动相:乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液(12∶88);检测波长:275 nm;流速:1.0 ml/min; 柱温:30℃;理论板数按红景天苷峰计算,应不低于2 000。在该色谱条件下,红景天苷的保留时间在5分钟
A2：以下是一般的色谱条件和流动相洗脱条件的示例：
色谱条件：
• 色谱柱：常用的柱型为反相色谱柱，如C18柱。
• 柱温：一般设定在室温或适当的温度下。
• 流动相：常见的流动相为水和有机溶剂的混合物，可以根据实验需要进行优化。常用的有机溶剂包括甲醇、乙腈等。
• 流速：根据柱子尺寸、样品性质和分析时间要求进行调整，一般在0.5-1.5 mL/min范围内。
• 检测波长：根据目标化合物的最大吸收波长进行设定，红景天苷一般为紫外光区域，如254 nm或280 nm。
流动相洗脱条件：
• 初始条件：常见的初始条件为90-100%水和10-0%有机溶剂。
• 洗脱梯度：在初始条件下，逐渐增加有机溶剂的比例。梯度条件可以根据目标化合物的保留时间和分离要求进行优化。
• 洗脱时间：根据样品性质、柱子类型和分析目的进行调整，一般在10-30分钟范围内。
Q：用Epiquik试剂盒提取组蛋白，分装好之后-80保存，第二天跑胶，有时候能跑出条带有时候没有，在同一块胶上有时候也是这个情况,需要将5个样品的H3条带一致，可有的泳道条带比较细或者没有，到底是为什么啊，分装的时候也是混匀的
A1：比较细可能是上样量不同的原因，调整上样量会改善
A2：出现条带不一致的情况可能有几个原因：
1. 技术操作：确保在提取组蛋白和分装样品时，操作技术要准确和一致。混匀样品时要均匀搅拌，确保每个样品中的组蛋白含量均匀分布。
2. 组蛋白含量和质量：不同样品中的组蛋白含量和质量可能有差异，这可能导致不同的染色强度和条带表现。确保在提取组蛋白时使用相似的样品量，并尽量控制组蛋白提取过程中的变异性。
3. 染色剂和胶条件：确保在跑胶时使用相同的染色剂和胶条件，包括染色剂浓度、电泳缓冲液和电泳条件。这有助于提高染色的一致性和可重复性。
4. 染色时间和显影：染色时间过长或过短，或者显影的时间不一致，可能导致条带强度不同。确保在染色和显影过程中严格按照说明书的建议进行操作，并控制反应时间一致。
A3：如果你希望获得一致的H3条带，可以尝试以下优化措施：
• 使用相同浓度的组蛋白样品，并确保提取的组蛋白质量和含量一致。
• 混匀样品时，确保充分混合，以确保样品的均匀性。
• 使用相同的染色剂和胶条件，并严格控制染色和显影时间。
• 尝试增加显影的敏感性，例如使用敏感度更高的显影剂。
考虑可能是每次上样量不均等所导致，建议蛋白样品上样量最好相等，不要过多。
A4：很可能是胶制的不均匀，导致某些孔道跑不出来
Q：想请问为什么有时候曝光出的蛋白条带会出现缺孔呢？
A1：可能是曝光的时间过短或者曝光强度过大，建议调整
A2：存在以下几个可能的原因：
1. 操作错误：在电泳过程中，如果样品未完全加载到凝胶孔洞中，或者样品在加载时滴落到周围的区域，可能导致某些孔位缺失。确保在加载样品时小心且准确地将样品加载到凝胶孔洞中。
2. 凝胶准备问题：如果凝胶的制备过程中存在问题，如凝胶孔洞形成不均匀或凝胶中存在气泡，可能导致某些孔位出现缺失。确保凝胶制备过程中的均匀性和完整性。
3. 电泳条件不当：不正确的电泳条件（如电场强度、电泳时间）可能导致某些孔位的蛋白条带无法迁移到所期望的位置。确保使用适当的电泳条件，根据蛋白的大小和目标分离效果进行优化。
4. 稀释问题：如果样品在加载前被过度稀释，某些孔位可能无法检测到足够的蛋白量，从而导致相应的条带缺失。确保在加载样品时使用适当的稀释比例，以保证在凝胶上获得可见的蛋白条带。
5. 蛋白质本身的问题：某些蛋白质可能在电泳过程中由于其特性而导致迁移异常或无法被检测到。这可能与蛋白质的大小、电荷或结构等因素有关。
A3：考虑可能是过高的蛋白上样量或一抗和二抗浓度过高导致。
Q：2000bp启动子区polyC结构克隆过程中丢失了一个C会对启动子活性有影响吗？
A1：很有可能影响启动子的活性，可以预实验检测下
A2：少一个c碱基如果是关键区域可能会影响启动子的正常启动。
A3：在一个2000bp的启动子区域中，丢失一个C碱基可能导致序列发生改变，可能会影响到与C碱基相邻的核苷酸序列的结构和功能。这可能会影响到该启动子的结合能力，调控因子的识别或其他与启动子功能相关的过程。
然而，具体的影响程度会受到多种因素的影响，包括丢失的C碱基在序列中的位置、相邻序列的组成和功能，以及特定基因的调控网络等。
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最后编辑于 2023-07-06 · 浏览 823
