快报 | 基因组学与转录组学联合分析结核分枝杆菌在体外环境对氨基糖苷类药物耐药水平

作者：魏文静，赵雨川，张晨晨，余美玲，巫株华，徐鏐粤，彭柯皓，吴志龙，李艳霞，王雪枝

第一作者及单位：魏文静，赵雨川，张晨晨，广东省结核病控制中心

通信作者及单位：王雪枝，李艳霞，吴志龙，佛山市第四人民医院

Whole-Genome Sequencing and Transcriptome-Characterized in vitro Evolution of Aminoglycoside Resistance in Mycobacterium tuberculosis

Microb Genom，2023，9(5)：mgen001022.

doi：10.1099/mgen.0.001022

研究背景

  结核病是世界上最致命的传染病之一，每天有超过4000人死于结核病，此外，新的结核病患者人数以接近每天28000人的速度增加，耐药性结核分枝杆菌 （MTB）是全世界关注的问题。越来越多的耐药结核病病例，包括耐利福平结核病(RR-TB)、耐多药结核病(MDR-TB)和广泛耐药结核病(XDR-TB)，极大地威胁着全球健康。广东是中国结核病负担最重的地区之一，据统计，2016—2020年广东省活动性肺结核病例为92851例，从这些病例中分离培养的30256株MTB，总耐药率达26.75%，耐多药分枝杆菌的比例为3.34%。

   目前对耐药结核病的治疗仍以化疗为主，以耐药检测结果为基础，再综合分析患者的治疗史、并发症、经济承受能力等因素，从一线、二线药物中选择4种以上组成治疗方案。其中，氨基糖苷类药物疗效显著且成本低廉，在耐多药结核病的治疗中发挥了重要作用。氨基糖苷类药物作用于细菌核糖体，抑制蛋白质合成，从而抑制细菌存活，此外还可以增加细菌细胞膜的通透性，从而促进药物进入细菌。

   与耐药相关的突变基因主要包括rrs (Rvnr01)、eis (Rv2416c)和whiB7（Rv3197A）等，位于rrs基因上的点突变A1401G、C1402T、G1484T被证实与阿米卡星（AMK）和卡那霉素（KM）高水平交叉耐药相关；位于eis、whiB7启动子区域的点突变被证明与KM耐药相关；此外，外排泵基因如Rv1258c和Rv0194的表达量改变也被报道与AMK或KM抗性相关。值得注意的是，目前的关于耐药相关突变的研究几乎都是基于临床菌株的基因组或靶向基因测序，然而临床菌株绝大多数属于结核分枝杆菌复合群，具有复杂的用药背景和多种突变类型，为了排除多种干扰项，本实验室采用体外单一药物诱导实验来研究耐药突变的产生与进化机制。

   在本研究中，通过逐代增加AMK或KM浓度的体外诱导实验，笔者建立了氨基糖苷耐药MTB的进化模型，揭示了MTB如何从易感菌到耐药菌，从低水平耐药到高水平耐药的进化过程。通过对每一代诱导菌株的测序分析，笔者发现rrs （A1401G）突变与KM和AMK高水平耐药直接相关，这一结果与广东地区氨基糖苷耐药MTB的主要突变类型一致。利用RNA-seq技术，本研究全面了解了四种代表性诱导菌株的转录组特征，并揭示了rrs突变菌株与rrs未突变菌株转录图谱的差异。本研究结果将提高对氨基糖苷类药物耐药机制的认知，并促进临床对氨基糖苷类药物的合理使用。

方法

  一、结核分枝杆菌临床菌株收集

  2016至2018年间，本单位从全省32家医疗机构累计收集713株MTB临床株，采用微量肉汤稀释法对14种抗结核药物的耐药水平检测。

   二、H37Rv体外诱导耐药实验

   选择H37Rv标准株作为初代菌株(P0)，分别在含有AMK和KM的中性罗氏培养基上连续传代培养，累计传27代（P1-P27）。参考临床上AMK和KM的临界浓度（critical concentration, CC）30μg/mL，将P1至P5的药物浓度分别设置为2^-4、2^-3、2^-2、2^-1、2⁰CC，P6至P10维持2⁰CC水平，P11至P15、P16至P20、P21至P27的药物浓度分别为2²CC、2³CC和 2⁴CC。与此同时，阴性对照组的传代在不含药的中性罗氏培养基上进行。对每一代的MTB都进行MIC检测和基因组测序。根据MIC的结果，AMK诱导的P3和KM诱导的P4的耐药水平出现了显著变化，为了研究其中的突变机制，将AMK-P3和KM-P4涂布在7h10平板上，各选择50个单菌落，对氨基糖苷耐药相关的rrs基因进行靶向测序。

   三、全基因组测序

  采用十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethylammonium bromide ，CTAB）提取和纯化临床菌株和实验室诱导菌株的基因组；使用TruSeq DNA试剂盒(Illumina, Inc.)构建PCR-free DNA文库；使用Illumina HiSeq 2000测序系统进行检测；参考序列为H37Rv基因组(GenBank NC_000962.3)。平均测序深度230×，基因组平均覆盖率99.5%。使用Pyseer (v1.3.9)软件对MTB临床株进行GWAS分析，位点检测参数为-max-dimensions 6 -min-af 0.01 (lrt-p value< 4.49e-5)，负荷检测参数为-max-dimensions 6 -min-af 0.001 (lrt-p value< 9.44e-6)。

   四、生长曲线检测

  挑选AMK-P3和KM-P4中具有不同种rrs基因型的单克隆，以H37Rv（P0）标准株作为对照，每个样本设置3个生物学重复，进行生长曲线检测。将菌株在中性罗氏培养基上复苏培养3周，然后将菌落转移到PBS中进行超声分散，将麦氏浊度调到1，然后吸取1mL转移到100mL 含10%OADC的7h9培养液中， 37C、5% CO₂静置培养，在适当的时间点取1ml测量吸光度（OD₆₀₀），持续45天。每组的重复样本独立计算然后求平均值，采用非配对Student 's t检验差异的显著性，并计算各组对数期的生长速率。

   五、总RNA提取和转录组测序

  将P0、AMK-P3-1、KM-P4-8、KM-P4-54、KM-P4-58（每株菌设3个生物学重复）在50ml 7h9培养液（含10%OADC）中扩培至对数期（OD₆₀₀≈0.8），离心收集沉淀，用Trizol法提取总RNA。使用Agilent 2100生物分析仪(Agilent Technologies, USA)评估每个RNA样品的质量和丰度；使用NEBNext ultra RNA Library Prep Kit (New England Biolabs, USA)构建cDNA文库，然后用Illumina Novaseq 6000平台进行转录组测序。使用Bowtie2 v2.2.6将Reads映射到H37Rv参考基因组以生成BAM文件，用HTSeq v0.6.0的FPKM软件分析基因表达值。采用DESeq v1.22.1检测差异表达基因(DEGs)，多重假设校正(BH, fd Benjamini/Hochberg)P值＜0.05的基因被认为是DEG，并进行功能富集（Gene Ontology, GO)分析和KEGG通路富集分析。

   六、RT-q-PCR验证

   根据转录组测序的结果，对DEGs表达量进行RT-q-PCR验证。使用试剂盒(HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis kit，Vazyme)将样本的总RNA转化为cDNA，采用SYBR Green作为荧光探针，使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix (Vazyme)对每个样品进行qPCR扩增。采用2 -∆∆Ct法计算mRNA表达量，采用unpaired Student‘s t-test确定差异显著性。

结果

   一、广东省氨基糖苷类耐药菌株的主要基因突变类型为rrs(A1401G)

    2016至2018年间，本单位从全省32家医疗机构累计收集713株结核分枝杆菌临床株，其中对氨基糖苷类敏感的有617株，对氨基糖苷类耐药的有96株；基因组测序结果表明，氨基糖苷类耐药菌株的基因突变类型主要包括eis -10G>A、eis -14C>T、 rrs C462T、rrs 514A>C、rrs A1401G和 tlyA 513-514 del，其中rrsA1401G的比例最高，在AMK耐药株和KM耐药株中的比例分别是18.9%和22.8%。GWAS分析结果表明，与AMK和KM的耐药关联显著性最高的突变为rrsA1401G，lrt-p value分别为7.31^e-10和1.53^e-13；其它基因的突变与AMK和KM分别有不同程度的相关性，比如CysT、Rv1012和 guaB2与KM耐药相关；Rv1312 和gpgS 与AMK 耐药相关。

  二、阿米卡星和卡那霉素的耐药进化图谱

  阿米卡星诱导传代过程中，AMK-P2开始出现对AMK、KM和卷曲霉素（CAP）的交叉耐药，其中AMK和KM的药敏值已经超过了检测试剂盒的上限（MICAMK＞16μg/mL，MICKM＞20μg/mL）,随着传代的继续，AMK和KM的MIC一直处于超出检测上限的水平，呈现稳定遗传的状态，而CAP的MIC水平在2μg/mL＞16μg/mL之间起伏；异烟肼（INH）从AMK-P3开始出现稳定耐药，但是MIC值在1μg/mL和＞4μg/mL之间起伏；此外，从AMK-P2至AMK-P27，链霉素（SM）、氧氟沙星（OFX）、对氨基水杨酸（PAS）、利福平（RIF）、吡嗪酰胺（PZA）的耐药水平随着传代呈现耐药和敏感交替的状态。

   卡那霉素诱导传代过程中，自KM-P2开始出现AMK、KM和CAP稳定耐药，KM-P2至KM-P27之间，AMK和KM的MIC一直处于超出试剂盒检测上限的水平，而CAP的MIC在4μg/mL至＞16μg/mL之间。除了在KM-P21出现过INH耐药，其整个传代过程未产生针对其它抗结核药物的耐药性。

   基因组测序和生信分析的结果表明，随着诱导药物浓度的增加，基因突变呈现累积的趋势。在AMK诱导过程中，从AMK-P1开始，位于nrdH和Rv3054c基因间区的突变（IGR mutation）开始出现，但菌株尚未表现出耐药性。AMK-P2至AMK-10之间，rrs(A1401G)和crp（Ser120Phe）出现并稳定遗传，hemA（Arg403Leu）在AMK-P11至AMK-P16出现，而 pckA（Arg432Gly）在AMK-P17之后出现；与AMK诱导相比较，KM诱导传代所产生的耐药突变种类较少，PlcC (Gln462Arg) 和 IGR mutation (nrdH-Rv3054c)在KM-P2出现，而rrs突变在KM-P4发生，之后的传代没有再积累新的稳定突变。值得注意的是，无论是AMK诱导还是KM诱导，rrs都出现A1401G和C1402T两种突变，但rrs(C1402T)在复合群中的比例非常小，且随着药物诱导浓度的增加而分别在AMK-P3和KM-P7之后彻底消失。表明rrs(A1401G)是一种优势突变，利于MTB在高浓度的氨基糖苷类药物环境下存活。

  三、转录组学分析结果

  为了进一步研究rrs不同突变类型的差异，笔者从AMK-P3和KM-P4的复合群中分离出了具有不同rrs基因型的单克隆，以P0作为对照分别开展转录组学分析。单克隆包括AMK-P3-1(rrs_A1401G)、KM-P4-8（rrs_A1401G）、KM-P4-54（rrs_C1402T）、KM-P4-58（rrs不突变），与P0对比，差异表达基因（DEGs）数量分别为274、49、608、609。GO分析和KEGG分析的结果表明，KM-P4-54的上调基因与氧化磷酸化、缺氧应激、精氨酸合成、泛醌活性、质膜呼吸链复合体I、细胞壁和质子转运ATP合酶复合体相关；KM-P4-58的上调基因主要富集在精氨酸和组氨酸的生物合成；KM-P4-54和KM-P4-58与能量代谢、固醇代谢、类固醇代谢相关的基因都出现了不同程度的下调；AMK-P3-1和KM-P4-8与铁载体组非核糖体多肽合成相关的基因上调。RT-qPCR验证的结果与转录组测序的结果基本相符，除了whiB7调节子的表达量有差异，RT-qPCR的结果表明whiB7调节子在AMK-P3-1和KM-P4-8都有显著上调，但在转录组测序中并未检测到与P0表达量的差异。

  生长曲线检测结果表明，AMK-P3-1和KM-P4-8的生长速度显著快于P0，而KM-P4-54和KM-P4-58的生长速度显著慢于P0，可能是因为AMK-P3-1和KM-P4-8上调了与多肽合成相关的基因，有促进细菌增殖的作用，而KM-P4-54和KM-P4-58与能量代谢相关的基因下调，影响了DNA复制的速度。

结论

   广东地区结核分枝杆菌临床株的氨基糖苷类耐药主要与rrs（A1401G）突变相关。阿米卡星与卡那霉素的体外诱导实验结果证明，随着药物浓度的增加和诱导时间的延长，rrs（A1401G）这种突变类型会在复合群中占据主导地位，这也解释了为什么氨基糖苷类耐药临床株的突变型以rrs（A1401G）为主。

本文来自于“中国防痨杂志期刊社”公众号