前体 mRNA (pre mRNA) 的引物设计问题
Q：各位战友，谁知道前体mRNA(不成熟mRNA)的qPCE引物如何设计呀？例如CHK1这一编码基因的pre mRNA如何设计？
A1：在设计CHK1前体mRNA的qPCR引物时，你可以使用NCBI提供的基因序列信息，包括外显子和内含子的边界，以及前体mRNA序列。利用引物设计工具，根据上述原则选择合适的引物序列。
A1：设计前体mRNA（不成熟mRNA）的qPCR引物需要考虑以下几点：
1. 选择引物位置：前体mRNA具有内含子（intron），引物应该位于两个相邻外显子（exon）上，以确保特异性和准确性。
2. 引物设计：引物应该跨越内含子边界，使其覆盖两个外显子，确保能够扩增前体mRNA序列。引物的长度通常在18-25个核苷酸之间。
3. 引物特异性：引物的序列应与前体mRNA的特定区域相匹配，避免与其他相关基因的mRNA序列或基因组DNA序列发生交叉反应。使用引物设计工具（如Primer-BLAST、Primer3等）可以帮助选择特异性引物。
在设计CHK1前体mRNA的qPCR引物时，你可以使用NCBI提供的基因序列信息，包括外显子和内含子的边界，以及前体mRNA序列。利用引物设计工具，根据上述原则选择合适的引物序列。
需要注意的是，前体mRNA的qPCR扩增会受到许多因素的影响，如前体mRNA的稳定性、引物的特异性和扩增效率等。在进行实验时，建议进行验证和优化，并与成熟mRNA的扩增结果进行比较，以确保实验结果的准确性和可靠性。
A3：首先在NCBI的GENE中进入mrna，点击HUMAN的。
找到该前体mRNA，并复制最长的mRNA序列。
进入Primer3 Input，并将mRNA序列复制primer3中，点击pick primers。即可初步得到靶基因的引物了（一般会提供5对引物）。
Q：如果是rna病毒，一步法可以扩出片段，用反转录成cdna，再用高保真酶扩不出来片段了，这是为啥，怎么可以看cdna有没有转成功呢
A1：考虑可能是你的高保真酶存在问题。
A2：如果使用一步法将RNA病毒转录为cDNA，并使用高保真酶扩增片段时出现扩增失败的情况，可能有几个可能的原因：
1. 反转录反应问题：反转录反应可能存在一些问题，如反应条件不当、反转录酶失活、核酸污染等。确保反转录反应的条件正确，使用高质量的反转录酶，并检查反应过程中是否存在污染物。
2. 引物设计问题：扩增片段的引物设计可能存在问题，如引物序列不合适、引物间相互作用等。确保引物序列与目标片段完全匹配，并避免引物之间的相互作用或二聚体形成。
3. 目标片段问题：目标片段本身可能存在结构变异、限制性酶切位点、RNA修饰等问题，导致无法成功扩增。确保目标片段的完整性和合适性，检查是否存在限制性酶切位点或其他结构特征。
为了验证cDNA是否成功转录，您可以尝试以下方法：
1. 聚合酶链反应（PCR）：使用转录后的cDNA作为模板，设计适当的引物进行PCR扩增。如果扩增出预期的片段，则表明cDNA转录成功。
2. 凝胶电泳：将扩增产物进行凝胶电泳分析，观察是否出现目标片段的带状条带。如果出现与预期大小相符的条带，则表明cDNA转录成功。
另外，如果一步法转录反应失败，您还可以尝试使用两步法进行反转录和扩增。在两步法中，先进行反转录反应得到cDNA，然后使用这些cDNA作为模板进行扩增。这种方法可能提供更高的扩增效率和特异性。
A3：可以做cdna电泳检测看cdna是否转成功
Q：请问一下，需要做顺铂干预的细胞实验，终浓度是20uM，买回来的粉末25mg，可以一次性溶解配成储存液吗？（用什么溶解呀？好像不能用DMSO？）储存液是分装了放在负20保存吗？需要避光保存吗？每次取出来用培养基稀释成工作液现配现用吗（工作液用培养基稀释？），还是工作液避光保存也可以用几天呢？
A1：可以一次性溶解配成储存液，可以用无菌水溶解，储存液分装了放在负20保存，需要避光保存
A2：可以用pbs溶解后然后放负20度分装，期间是需要避光保存的
A3：对于顺铂（Cisplatin）的溶解和储存，以下是一些建议：
1. 溶解：顺铂通常不宜使用DMSO来溶解，因为它会与DMSO反应形成沉淀。您可以选择使用适当的溶剂，如无菌的水或细胞培养基来溶解顺铂。请参考产品说明书或相关文献以获取溶解建议。
2. 储存液：一次性溶解25mg的顺铂可能会导致储存液过浓。您可以根据需要制备适当浓度的储存液。储存液通常应存储在-20摄氏度的冰箱中，以防止顺铂的降解。此外，建议分装成小容量的储存管中，以避免多次冻融。
3. 避光保存：顺铂对光敏感，因此建议在制备和保存过程中避免暴露在光线下。使用遮光容器或铝箔包裹可以帮助保护顺铂免受光的影响。
4. 工作液的制备和稀释：每次使用时，您可以从储存液中取出适量的顺铂，并在培养基中进行稀释以制备工作液。稀释倍数可以根据您的实验需求和预定终浓度进行调整。工作液的保存时间应视具体实验而定，一般来说，建议尽快使用，最好在当天内使用。
Q：请问一下各位大佬，hsa-miR-29c-5p和hsa-miR-29c-3p属于同一个miR吗
A1：是同一mirna的不同亚型，分子结构上存在差异
A2：这两个mirna属于同一个mir的不同亚型。
A3：hsa-miR-29c-5p和hsa-miR-29c-3p实际上是同一个miRNA（microRNA）的不同亚型。miRNA是一类非编码RNA分子，可以通过与靶标mRNA相互作用来调节基因表达。miR-29c是指miRNA家族中的一员，而miR-29c-5p和miR-29c-3p则是miR-29c在成熟状态下的两个不同的亚型，分别称为5p链和3p链。这两个亚型可能具有不同的靶向基因和功能。
Q：质粒提取浓度只有50ng/ul可以用于转染吗？
A1：可以的，如果效率不高可以少量多次的转染
A2：需要看转染细胞和转染试剂种类
我试过20ml体积PEI转60ng/ul浓度的质粒 可以转进去表达
A3：质粒提取的浓度为50 ng/μl可以用于转染，但转染效率可能会受到影响。转染通常需要足够高的质粒浓度以确保足够的DNA分子进入目标细胞。一般来说，较高的质粒浓度可以提高转染效率。
通常建议将质粒提取的浓度控制在100 ng/μl以上，以确保足够的质粒数量被转染到细胞中。如果质粒提取的浓度较低，可以尝试增加转染物质的用量，或者进行浓缩或纯化步骤以提高质粒的浓度。
此外，转染效率还受到其他因素的影响，例如目标细胞类型、转染试剂和转染条件等。因此，除了质粒浓度外，其他实验条件也需要进行优化，以获得最佳的转染效果。
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最后编辑于 2023-07-05 · 浏览 1975
