protocol 分享｜HIV 耐药检测——PCR 法

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简介

HIV 耐药性检测可以进行表型或基因型检测，基因型检测是最常用的检测方法，该方法主要是通过 PCR 及基因测序的手段得到 HIV 耐药相关基因序列，分析基因组中与耐药相关的氨基酸突变。

原理

用 PCR 扩增 HIV 样品基因片段（gag、env 和 pol），并对扩增的目的片段进行基因测序，将测序结果进行比对，以此确定是否存在耐药变异。

用途

PCR 检测艾滋病患者感染 HIV 病毒的 gag、env 和 pol 基因变异情况，为 HIV 的预防和治疗提供参考。

材料与仪器

PCR 仪、PCR 缓冲液、dNTP 混合物

HIV 的 cDNA、TaqDNA 聚合酶

去离子水、DNA 纯化回收试剂盒

PCR 引物、电泳仪

步骤

通过 PCR 法检测 HIV 耐药的步骤如下：

1、设计引物：选取需要扩增的基因片段（gag、env 和 pol）设计引物；

2、准备无菌的 10 μL、200 μL、1000 μL 枪头、PCR 管；

3、向 PCR 管中加入 1 μL 的（2.5 mM）4×dNTPs 混合物、5 μL 的 10×PCR 缓冲液、5 μL 的（25 μM）MgCl2、1 μL 上游引物（10 μM）、1 μL 下游引物（10 μM）、0.2 μL TaqDNA 聚合酶、3 μL 的 HIV cDNA，剩余的加去离子水补足到 50 μL，然后混匀；

4、设置第一轮巢式 PCR 反应程序：95 ℃ 预变性 3 min，95 ℃ 变性 30 s，55 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 1 min，变性、退火、延伸三个操作进行 35 个循环，72 ℃ 终延伸 5 min，4 ℃ 保存；

5、第二轮巢式 PCR 反应：向 PCR 管中加入 1 μL 的（2.5 mM）4×dNTPs 混合物、5 μL 的 10×PCR 缓冲液、5 μL 的（25 μM）MgCl2、1 μL 上游引物（10 μM）、1 μL 下游引物（10 μM）、0.2 μL TaqDNA 聚合酶、5 μL 的第一轮巢式 PCR 产物，剩余的加去离子水补足到 50 μL，然后混匀；

6、设置第二轮巢式 PCR 反应程序：95 ℃ 预变性 3 min，95 ℃ 变性 30 s，55 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 1 min，变性、退火、延伸三个操作进行 30 个循环，72 ℃ 终延伸 5 min，4 ℃ 保存；

7、PCR 产物用 1% 的琼脂糖凝胶电泳，鉴定正确后用 DNA 凝胶纯化回收试剂盒进行纯化回收，用于 PCR 扩增和测序；

8、将获得的 HIV 的 PCR 产物送去测序，将测序结果与野生型序列进行比对，判断是否有耐药相关基因突变。

注意事项

引物结合位点可能出现多位点结合，可能会降检测的准确性 ；实验材料要保证无菌，避免 PCR 反应污染。

常见问题

（1）电泳产物出现多条条带。

（2）模板、引物质量不好。

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