求助 表达载体构建问题

将目的基因和T载体连接，测序成功的菌液提取质粒进行双酶切与表达载体连接，通过菌落PCR和质粒酶切验证正确，送测序，用载体上的反向引物测序，结果酶切位点speI处的碱基A丢失了。由于该酶切位点附近还有一个A，所以依然可以使用speI进行酶切。但是这个碱基的缺失会影响蛋白的表达呀。如何解决这个问题？

同时送了三个连了不同目的基因的菌液都是这个现象。