如何提取乙酰胆碱转移酶？
Q：使用试剂盒，一般需要多少乙酰胆碱转移酶？如何提取？本人要提取褐飞虱的乙酰胆碱转移酶，谢谢各位前辈
A1：常用的提取方法有：
（1）柱层析提取法：有多种层析柱可供提取不同的神经肽，其中较为方便的是用Sep-pak C18层析柱提取。主要步骤：
①柱的预处理：该柱有两头，长头连接注射器，可注入溶液与样品，短头为排出口。预处理时注入乙腈10ml。蒸馏水20ml，使柱中的生物胶活化。
②注入样品（如血浆、脑脊液、腹水、尿等）：样品中的水份流出，生物活性肽、蛋白及杂质等吸附在生物胶上。血浆上柱前，如先去除蛋白，可增加柱子的使用时间。
③淋洗：用4%HAC溶液100ml注入柱中，以洗去一些杂质。
④洗脱：用7ml酸性乙腈作为洗脱剂，注入柱中，把生物活性肽洗脱下来，收集在塑料指形管中。
⑤清洗：用乙腈、蒸馏水清洗柱子，以备后用。
⑥将洗脱液吹干，低温保存待测。测定时可加入一定量的缓冲液溶解。
A2：以下是一般的提取步骤：
1. 样本制备：收集褐飞虱样本，并将其组织（如整个体、器官或细胞）分离或粉碎。可以使用显微注射器、组织研磨器或其他适当的方法来处理样本。
2. 组织破碎：将样本加入一个适当的缓冲液中，如磷酸盐缓冲液（PBS）。使用离心或超声波等方法，破碎组织细胞，释放出AChE。
3. 离心：离心样本，以去除细胞碎片和其他固体颗粒。收集上清液，其中含有提取的AChE。
4. AChE检测：使用商用AChE检测试剂盒，按照说明书中的步骤进行测定。根据试剂盒的不同，可能需要不同的乙酰胆碱转移酶的用量。请仔细阅读试剂盒的说明书，按照建议的用量进行操作。
5. 分析数据：根据试剂盒的说明书，使用光度计或荧光测量仪等仪器，测量AChE的活性。根据提供的标准曲线，计算样本中AChE的活性。
Q：WB条带长短不一，该怎么调？
A1：建议根据实际出来的内参结果调整上样量试试看。
A2：对于WB条带长短不一的情况，我们可以尝试以下方法进行调整：
1. 改变电泳时间：如果条带过短，可以尝试增加电泳时间；如果条带过长，可以尝试减少电泳时间。
2. 改变电泳电压：如果条带过短，可以尝试增加电泳电压；如果条带过长，可以尝试降低电泳电压。
3. 改变样品浓度：如果条带过短，可以尝试增加样品浓度；如果条带过长，可以尝试减少样品浓度。
4. 改变样品加载量：如果条带过短，可以尝试增加样品加载量；如果条带过长，可以尝试减少样品加载量。
5. 检查电泳装置：如果以上方法都不起作用，可以检查电泳装置是否有问题，如电极是否均匀，电泳缓冲液是否正常等。
A3：出现这样的结果，问题出在每一步都有一定的可能性，比如电泳，转膜，敷抗体，显色等等。但据我所知，WB 最关键的还是转膜和敷抗体步骤，可能是你敷抗体的时候敷的不均匀。我的建议是你再认认真真，仔仔细细做几遍，很可能重复性就做出来了。
Q：WB实验中，内参出现上下两个条带，是什么原因？
A1：具体原因可能是该蛋白出现了同源二聚体，故都可以被抗体识别出来或者该蛋白有部分降解，但是未降解部分依然可以和抗体结合，另外抗体特异性不高，也会出现非特异性的结合，造成出现两条或者多条带，所以Western blot会出现两条带
A2：loading buffer 有问题，二抗没必要孵育2小时，室温1小时就将可以。至于内参，一抗二抗室温各孵育30min都行
A3：内参（参考蛋白）出现上下两个条带时，可能是由以下几个原因造成的：
1. 表达多个变异形式：内参蛋白可能存在多个变异形式，例如剪切异构体或翻译后修饰引起的不同形式。这些变异形式可能具有不同的分子量，导致上下两个条带的出现。
2. 翻译后修饰：内参蛋白可能受到翻译后修饰的影响，如磷酸化、糖基化或乙酰化等。这些修饰可以导致蛋白的分子量发生变化，从而产生上下两个条带。
3. 降解或裂解产物：内参蛋白可能被降解或裂解为多个片段，在Western Blot中显示为上下两个条带。
4. 蛋白交联：某些情况下，内参蛋白可能与其他蛋白发生交联，形成复合物或聚合物。这种交联可能导致蛋白复合物的分子量增加，从而产生上下两个条带。
Q：成骨诱导到底要怎么做才能不污染呀！每次洗不是染料洗不干净，就是被我把细胞膜片吹起来了
A1：首先要对内、外环境定期进行消毒灭菌处理，其次操作时必须保持无菌操作，这样基本上就可以不被污染。
A2：按规章制度进行实验操作，对培养环境定期消毒杀菌，使用无菌的培养器械，工具和试剂，按操作规程对细胞染色进行洗涤。
A3：不被污染的话，主要是严格按照无菌技术，还有就是培养环境定期打扫
A4：在进行成骨诱导实验时，确保避免污染和细胞膜片损伤的关键步骤如下：
1. 实验环境和操作：在实验室中保持洁净的工作环境，经常清洁实验台面、仪器和工具，使用消毒剂消毒工作区域。
2. 无菌技术：在实验操作过程中，遵循无菌技术原则，使用无菌培养器皿、无菌操作工具和无菌试剂。
3. 细胞培养和传代：使用无菌技术进行细胞培养，确保培养基、培养器皿和传代操作无菌。避免细胞感染和污染。
4. 染料洗涤：在进行细胞染色或洗涤步骤时，确保彻底洗去多余的染料。进行充分的洗涤步骤，使用适当的洗涤缓冲液，按照实验方案中的规定次数进行洗涤。
5. 细胞膜保护：当进行洗涤步骤时，避免使用过高的压力或气流，以防止细胞膜损伤。可使用缓慢而均匀的吸液或加液技术，避免产生强烈的流动。
Q：在ELISA定量或半定量检测中，如何选择合适的检测二抗或检测方式？
- 将AAV病毒以静脉注射的方式给药猴子；
- 检测猴子产生的抗AAV抗体，即免疫原性检测；
- 选择抗猴的特异性HRP-二抗或通用型HRP-重组蛋白G二抗进行检测，两者的差异是否会影响阴阳性的判断；
- 一般检测ADA是通过桥连法，以保证检测的特异性；直接用商品化的二抗检测和用桥连法进行检测是否有特异方面的影响？
A1：一般来说，二抗应选用与使用的一抗相同的物种来源，例如：如果你的一抗是小鼠源的单克隆抗体，二抗则选抗小鼠的二抗（山羊抗小鼠或者兔抗小鼠等均可）；如果一抗是从兔血清里制备的兔源多克隆抗体，则相应的二抗需要选择抗兔的二抗。即根据一抗的物种来源选择相应的抗该物种的二抗。
A2：二抗应选用与使用的一抗相同的物种来源，二抗来源一些特殊实验，如双标实验中需要多注意，需要选择与两个一抗都不同来源的第三个种属二抗也可以使用
A3：在ELISA定量或半定量检测中，选择合适的检测二抗或检测方式可以根据以下几个方面考虑：
1. 目标分析物和样本类型：确定您要检测的目标分析物是什么，以及样本类型是什么。根据目标分析物的种类和性质，选择合适的检测二抗。对于检测猴子产生的抗AAV抗体，您可以选择抗猴的特异性HRP二抗或通用型HRP-重组蛋白G二抗。
2. 特异性和交叉反应：检测二抗的特异性是非常重要的。确保选择的检测二抗能够特异地结合目标分析物，而不会与其他非特定抗体发生交叉反应。这有助于准确判断阴阳性。
3. 检测灵敏度：不同的检测二抗可能具有不同的检测灵敏度。根据您的实验需求，选择适当灵敏度的检测二抗。这将有助于您获得可靠的定量或半定量结果。
关于ADA检测，使用桥连法或直接商品化的二抗检测可以影响特异性的判断。桥连法具有较高的特异性，可以减少非特定抗体的干扰。但是，使用商品化的二抗进行直接检测可能更简便和快速。根据您的实验需求和准确性要求，选择适当的方法进行ADA检测。
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最后编辑于 2023-06-27 · 浏览 683
