快报 | 结核分枝杆菌III-A亚型CRISPR-Cas系统的特征

作者：Insaf Hamdi , Funmilayo Boni , 申庆磊, Liadrine Moukendza , Li Peibo , 谢建平

第一作者及单位：Insaf Hamdi 西南大学生命科学学院，现代生物医药研究所

通信作者及单位：谢建平 西南大学生命科学学院，现代生物医药研究所

Characteristics of subtype III-A CRISPR-Cas system in Mycobacterium tuberculosis: An overview

Infect Genet Evol，2023，112:105445.

doi: 10.1016/j.meegid.2023.105445

PMID: 37217031

研究背景

CRISPR-Cas系统是RNA介导的适应性免疫途径，可触发细菌和古菌检测和破坏入侵的噬菌体和质粒。CRISPR-Cas系统普遍存在于原核生物中，工具价值巨大。本研究总结了20多年来关于结核病的致病菌-结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosisM. tuberculosis）的特异性的CRISPR-Cas III-A系统，以及III型中几个亚型及其防御机制之间的差异。结合最近发现的抗CRISPR (Acrs)蛋白，阐述了逆转录酶(RT)和保守的核酸酶对III型CRISPR-Cas系统的作用，及其在寻找新型抗结核药物中的应用。

研究方法

   本研究总结了目前CRISPR Cas III型系统的分类，尤其是结核分枝杆菌的III-A亚型，抑制III型系统的抗CRISPR蛋白。阐明了保守核酸酶和逆转录酶(RT)在细菌防御中的功能，以及它们与CRISPR-Cas III型系统的特异性联系。CRISPRi方法及其在抗结核药物研发中的应用。

研究结果

  1. III型CRISPR-CAS系统的特点：CRISPR-Cas10 (III型)系统的核酸干扰过程与所有其他已知的CRISPR-Cas系统截然不同。与这种类型的免疫系统有关的是三个过程：破坏可移动遗传元件的DNA (dsDNA, ssDNA)、RNA (ssRNA)以及合成环寡腺苷酸(cOA)。与I和VI两个系统相比，III型CRISPR-Cas系统的组成有很大差异。III型的效应模块包括CRISPR RNA (crRNA)及Cas蛋白，其中crRNA是一种靶向外源DNA或RNA的效应复合体。III型系统的标志性基因是Cas10，是DNA或RNA转录依赖性切割的大亚基，通常包含两个不同的结构域:一个无活性的结构域以及一个有活性的聚合酶/环化酶的结构域。对III型效应复合体的比较研究发现，Csm III型家族的A、B、D、E和F与Cmr (III-B和III- c)具有大致相同的形状，而Cas相关蛋白略有差异。

   2. 抗CRISPR蛋白Acr：噬菌体、病毒和其他可移动的遗传元件已进化出编码CRISPR-Cas系统抑制剂的基因。这些抑制蛋白被称为Anti-CRISPR (Acr)，是一种序列多样的小蛋白(约330 aa)。绝大多数抗CRISPR蛋白仅抑制一种亚型CRISPR-Cas系统。2013年，首个CRISPR Cas抑制剂在噬菌体攻击铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的系统中被发现。随后，Acrs家族的数量增加到20多个。Acrs通过降低1类和2类CRISPR-Cas的核酸酶功能、修饰原间隔区或PAMs或抑制靶DNA/RNA的识别来抑制它们的功能。在古菌中鉴定了第一个抗III 型CRISPR-Cas系统的蛋白Acr，并命名为AcrIII-B1，由硫化叶菌（Sulfolobus）噬菌体SIRV2 gp48产生，可抑制冰岛硫化叶菌（S.islandicus）的CRISPR III-B亚型。这种抑制仅限于Cas III型系统。Cmr-a和Cmr-g两个效应复合物产生环寡腺苷酸(cOAs)，激活辅助蛋白Csx1，cOA信号通路对Csx1 RNA酶活性至关重要，而Acr III-B通过抑制cOA信号通路与它们相互作用。因此，AcrIII-B可抑制与SIRV2转录本互补的III-B亚型crRNA。此外最近发现另一种新的Acr蛋白可抑制III-A亚型:AcrIII-1。

   3. III型CRISPR-Cas保守的核酸酶：通常，CRISPR-Cas系统的应答包括三个步骤：适应、crRNA合成和干扰。在这一过程中，重复序列-间隔序列(repeat-spacer array)被用来生成冗长的前体crRNA (pre-crRNA)，再经加工，产生单间隔的成熟crRNA。成熟的crRNA由绝大多数功能性III型系统产生，其3 '端长度变化为6个核苷酸。类似的切割模式被认为是位于效应复合物内的Csm3/ Cmr4亚基副本提供的结果；这种切割有规律。crRNA的3 '端成熟过程需要一个或多个核酸酶。RNA酶R (RNase R)和PNPase (PNPase)是两种内源性核酸酶，它们共同切割中间crRNA的3 '端，刺激表皮葡萄球菌产生有效的抗质粒免疫应答。

   4. 逆转录酶相关的III型CRISPR-Cas系统：大多数古菌和细菌存在逆转录酶(RT)或RNA依赖的DNA聚合酶。该酶是一种DNA聚合酶，负责将ssRNA转录成DNA，是微生物群落多样性的产生和维持的关键因素之一。系统发育研究表明，这些RTs可能有不同的起源：第II组内含子RTs、CRISPR-Cas系统、产生多样性的逆转录因子(DGRs)和流产噬菌体感染系统(ABi)。由于RT在CRISPR免疫防御机制中的关键作用，CRISPR-Cas相关RT系统受到了特别关注。除了逆转录酶干扰(Reverse Transcriptase Interference)之外，CRISPR-Cas系统可能使用另一种适应策略，包括从外源DNA获得RNA间隔区。大多数CRISPR相关的RTs属于II组内含子，而来自Abi-P2 RTs的RTs与I-C型系统相关，促使crRNA合成。与CRISPR-Cas系统III型连接的基因与Cas1蛋白或Cas6成熟酶的C端融合。一些研究表明，这些蛋白的活性区域存在相互作用。由于缺乏对Cas 1、RT和Cas 6蛋白的功能域及其在这一过程中的独特功能的了解，这些蛋白相互作用和获得RNA的方法仍有待确定。

   5. 结核分枝杆菌复合群中的CRISPR-Cas系统：比较141个分枝杆菌（Mycobacteria）的基因组发现：CRISPR-Cas- III-A系统是结核分枝杆菌复合群（M. tuberculosis complex MTBC)特有的。CRISPR- Cas III-A型系统可能在厚壁菌门（Firmicutes）和放线菌门（Actinobacteria）之间发生了交换，因为MTBC CRISPR簇与嗜热沙门氏菌的CRISPR簇相似。结核分枝杆菌复合群的IS6110的主动转座影响CRISPR基因组区域的发育。结核分枝杆菌的祖先株只有一个长CRISPR阵列。IS6110的转座破坏了这一阵列，在大多数结核分枝杆菌菌株中产生了两个CRISPR位点，两个CRISPR位点被IS6110分隔。这些活性转座子影响了CRISPR基因座的进化，导致基因重组和缺失。这些差异可能导致新的病原学特征，正如之前北京谱系所示，北京谱系进化为适应性更强的病原体。III型CRISPR-Cas类型系统很可能是在MTBC和STB-A的共同最近祖先中通过水平基因转移驱动获得。

   6. 结核分枝杆菌H37Rv中的CRISPR III-A系统：结核分枝杆菌是III-A型系统(Csm)的原型。III-A型Mtb或(Csm/ Cas)系统由两种不同的CRISPR阵列组成：CRISPR 1(17次重复)和CRISPR 2(23次重复)，两个IS6110转座酶基因在两个CRISPR位点之间，两个适应蛋白Cas 1和Cas 2，一个核酸内切酶Cas 6和一个Csm复合体(1到6)。这表明结核分枝杆菌在其CRISPR串联和Cas基因的数量和排列上具有独特性。结核分枝杆菌III-A 系统大亚基Cas 10的环化酶域被激活，通过3-6个AMP单体聚合来合成一系列cA3到cA6的第二信使环寡腺苷酸(cOA)。这一重要的第二信使利用CRISPR相关罗斯曼折叠(CRISPR Associated Rosman Fold)或CARF结构域与下游效应物复合物结合，并与核糖核酸酶Csm6连接，从而切割相应的RNA。结核分枝杆菌的CRISPR免疫系统通过核糖核酸酶和cA6信号通路获得，而不是通过Cas 10蛋白的HD结构域进行DNA切割。这些发现表明，结核分枝杆菌中的CRISPR干扰系统是可行的，并产生了多种线性和环状寡核苷酸。

  7. CRISPR-Cas干扰与抗结核药物：CRISPR-Cas基因组编辑研究获得了2020年诺贝尔化学奖。与Cas9相比，从CRISPR-Cas 9系统开发的CRISPRi是一种抑制细菌(如结核分枝杆菌)基因表达的方法，使用的是经过修饰的失活Cas9蛋白(dCas9)。dCas9由于其核酸内切酶域的突变而失去核酸内切酶活性，以及针对目标基因的特异性小引导RNA，该CRISPRi系统可以干扰靶基因的转录。在分枝杆菌中开发了一种有效的CRISPRi工具，并分别在结核分枝杆菌和耻垢分枝杆菌中以mmpL3为靶基因，成功降低了该必需基因的转录水平。CRISPRi质粒可在1周内制备完成，转化1次即可获得转录敲降菌株。分枝杆菌CRISPRi技术为加速发现新的靶基因和开发新的高效抗结核药物提供了一种快速、简便的遗传学技术。

讨论

   CRISPR是生命科学史上的一项重大发现。它通常与许多细菌和古菌中的CRISPR相关蛋白(Cas)共同发挥功能，对外源核酸进行免疫防御。由于CRISPR-Cas III型的效应体复合物的复杂性和变异性，它具有广泛的应用前景。将来可能发现更多的CRISPR系统种类和亚类。逆转录酶(RT)与III型系统的联系知之甚少，它可以在细菌CRISPR防御过程中发挥重要作用。此外，古菌III型抗CRISPR 蛋白Acr抑制剂已经有研究，这将为确定更多的Acr类型提供基础，指导噬菌体治疗。CRISPRi是发现新的抗结核药物的重要工具。

本文来自于“中国防痨杂志期刊社”公众号