protocol 分享｜內溶素的活性检测

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简介

作为噬菌体衍生的酶，内溶素本质是一种蛋白分子，其通过分解细菌细胞壁的肽聚糖成分，帮助噬菌体颗粒从细菌宿主释放，可在噬菌体复制过程中表达，破坏细菌细胞壁肽聚糖的关键化学键。

原理

利用内溶素对宿主菌的裂解效果检测能够反映其抗菌活性，将内溶素与宿主菌共孵育后，通过浊度测定统计加入内溶素前后的 OD600 的变化，利用细菌计数法测定活菌数，并在光镜与透镜下观察加入内溶素前后宿主菌的形态差异来检测抗菌活性。

用途

为治疗抗生素耐药的细菌感染提供潜在解决方案。

材料与仪器

仪器：

离心机、多功能酶标仪、光学显微镜

透射电镜

试剂：

宿主菌（Kp3、CRKP 等，可多选几种）

LB 培养基、PBS 缓冲液

反应缓冲液（0.5 M NaCl，20 mM Tris-HCl，pH 7.4）

3% 磷钨酸钾

步骤

1、OD600 测定分析：

挑取宿主菌单菌落接种于 LB 培养基中过夜，次日以 1:100 的比例接种至新的 LB 培养基中培养 3 h，至 OD 值达到 0.8~1.0 之间。

取 1.5 mL 的菌液 16000 g 离心 2 min，PBS 洗涤 2 次后重悬于 500 μL Tris-HCl 缓冲液（含 1% TritonX-100）中，注入 96 孔板中进行分析，每孔注入 180 μL，实验组中加入 20 μL 终浓度为 2 mg/mL 的纯化内溶素蛋白，阴性对照组加入反应缓冲液，通过多功能酶标仪检测。

2、细菌计数法测定分析：

挑取宿主菌单菌落接种于 LB 培养基中过夜，次日以 1:100 的比例接种至新的 LB 培养基中培养 3 h，至 OD 值达到 0.8~1.0 之间。

取 1.5 mL 的菌液 16000 g 离心 2 min，PBS 洗涤 2 次后重悬于 500 μL Tris-HCl 缓冲液（含 1% TritonX-100）中，取出 10 μL 样本作为零时刻阴性对照组，再向原有菌液加入终浓度为 2 mg/mL 的纯化内溶素蛋白，37 ℃ 孵育 30 min 后取出 10 μL 作为实验组，采取 10 倍稀释法对各组样品涂布平板计数，重复三次取平均值。

3、光镜分析：

挑取宿主菌单菌落接种于 LB 培养基中过夜，次日以 1:100 的比例接种至新的 LB 培养基中培养 3 h，至 OD 值达到 0.8~1.0 之间。

取 1.5 mL 的菌液 16000 g 离心 2 min，PBS 洗涤 2 次后重悬于 500 μL Tris-HCl 缓冲液（含 1% TritonX-100）中，实验组中加入 20 μL 终浓度为 2 mg/mL 的纯化内溶素蛋白，阴性对照组加入反应缓冲液，每组取 50 μL 样品经亚加蓝染色后于光镜下观察。

4、透射电镜分析：

样品制作同光镜样品，每组取 50 μL 样品滴到有膜的铜网上，静置数分钟后，用滤纸吸取多余的液体，滴上 3% 磷钨酸钾对样品进行负染色，待干后电镜下观察。

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