干预 CCK8 检测细胞增殖

发布于 2023-06-13 · 浏览 679 · IP 浙江浙江

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Q：rt，我想研究对照、造模组和药物干预组的CCK8值的大小以此来确定我这个药可以恢复细胞增殖。问题来了，我们常规取蛋白的话是CN完培（含血清），造模内毒素（使用无或低血清培养基），加药组（使用无或低血清培养基）。那么我cck8也可以来这样干预吗。但是有人提出造模和加药干预组也应该使用完培，理由是无或低血清培养基本身会影响细胞增殖，并不全是内毒素的作用，甚至可能不是内毒素的作用。但我们造模时候是将无或低血清培养基+内毒素视为造模方法，因此无或低血清培养基也是造模的一部分，这样子看cck8应该也可以这样操作。百思不得其解。

A1：cck8建议也使用完培，因为无血清培养基确实会对细胞造成损伤

A2：对于你的问题，常规取蛋白的方法是CN完培（含血清），而造模组和药物干预组则使用无或低血清培养基。你想知道是否可以在这些组中使用CCK8进行评估。

有人提出造模组和药物干预组也应该使用完培，理由是无或低血清培养基本身会影响细胞增殖，不全是内毒素的作用。然而，造模时使用的无或低血清培养基加上内毒素被视为造模方法，因此无或低血清培养基也是造模的一部分。

在这种情况下，你可以考虑以下几点：

1. 了解先前研究的做法：查阅相关的研究文献，了解先前研究中在类似实验中如何处理对照组、造模组和药物干预组。这可以提供有关最佳实践的指导。

2. 与同事和导师讨论：分享你的疑虑和困惑，与其他人讨论这个问题。他们可能能够提供实际经验和见解，并帮助你做出决策。

3. 进行实验验证：考虑在你的研究中进行一些小规模的实验验证。尝试使用不同的培养基和处理条件，并比较其对细胞增殖的影响。这样你可以评估不同方法对结果的影响，并选择最适合你研究的方法。

Q：用胰酶消化贴壁细胞，发现很难消化下来，该怎么办？

A1：排除细胞状态不好的原因，可以考虑换下胰酶试试看

A2：一、trypsin本身，胰酶没有在冰箱中放置。或者没有加入EDTA会影响其消化效果的。

二、增加消化时间，提高trypsin 浓度。2*,4*的trypsin本身对细胞伤害不大。至少对cho细胞，暴露在1*trypsin溶液中，近一个小时，细胞活性没有显著下降的。所以，可以提高trypsin浓度为2*,或者消化时间延长些。

三、小tricks，消化的时候，轻轻拍打方形瓶底部，或者在37摄氏度放置几分钟，都可以提高消化效果。

另外，贴壁细胞不好消化，本身是好事。说明细胞长得很壮。下次传代的时候，可以少留一些。覆盖率长到90%消化就可以，不一定非要等到长满。

A3：难消化的话可以增加胰酶的浓度，或在胰酶内加入edta辅助消化

A4：有几种解决方法：

1. 增加胰酶浓度：尝试增加胰酶的浓度来增强消化能力。可以逐渐增加胰酶的浓度，然后进行适当的消化时间，以观察是否可以更有效地消化贴壁细胞。

2. 延长消化时间：如果胰酶的浓度已经足够高，可以尝试延长消化的时间。有些细胞类型的表面附着物质可能较难消化，需要更长的时间来获得较好的消化效果。试验过程中要注意不要超过细胞的最大耐受时间。

3. 添加细胞分散剂：如果胰酶仍然无法有效消化贴壁细胞，可以尝试添加适量的细胞分散剂，如Trypsin-EDTA（胰蛋白酶-EDTA）或Accutase等。这些分散剂具有更强的细胞分散能力，有助于将贴壁细胞从培养基底上分离下来。

4. 优化细胞处理条件：除了胰酶消化条件的调整，还可以考虑优化其他细胞处理条件，如细胞培养基的配方、温度、pH值等。某些细胞可能对特定条件更敏感，对消化的效果也会有影响。

5. 尝试其他方法：如果使用胰酶或细胞分散剂仍然无法有效消化贴壁细胞，可以尝试其他细胞分离或解聚的方法，如机械刮取、离心沉淀、胶体溶解酶等。这些方法可能对特定细胞类型或实验条件更适用。

Q：请问黑胶虫污染的问题如何解决呢？

A1：1. 确认污染：首先，通过使用合适的方法进行黑胶虫检测，如PCR、DNA染色、培养基检测等，确认细胞确实受到黑胶虫污染。

2. 隔离受污染细胞：将受污染的细胞与其他无污染的细胞分开，避免进一步传播。

3. 抗生素处理：使用适当的抗生素来清除黑胶虫污染。常用的抗生素包括环丙沙星、多西环素等，可以按照厂家建议的剂量和处理时间进行应用。在使用抗生素之前，可以通过培养基预处理、酸化或冻融处理等方法增强抗生素的效果。

4. 清除实验室环境：黑胶虫易于在实验室中传播，因此需要彻底清除实验室中的黑胶虫污染源。这包括彻底清洁和消毒培养器具、工作台、显微镜等设备，更换培养物和培养基，同时加强实验室的卫生措施和规范操作。

5. 监测和预防：定期对细胞进行黑胶虫检测，确保细胞培养的无菌状态。同时，建立黑胶虫的预防措施，如定期更换培养基、避免污染源的引入、定期清洁实验室设备等。

A2：换优质的胎牛血清，也可以使用磺胺、四环素、贝尼尔、庆大霉素进行洗涤

A3：可以用左氧氟沙星去除，如果污染严重建议重新培养，因为黑胶虫不易去除

Q：细胞中发现黑胶虫污染怎么办？左氧氟沙星该怎么用？

A1：处理方法可以换优质胎牛血清，可以用伯胺奎、磺胺、四环素、贝尼尔、庆大霉素进行洗涤。不建议使用左氧氟沙星洗涤。

A2：黑胶虫我们都是用黑胶虫祛除剂。

A3：建议抛弃受污染的细胞：处理受污染的细胞培养物，将其抛弃。避免与其他细胞培养物接触，以防止进一步传播。清除实验室设备和试剂：对实验室中可能被污染的设备、培养皿、试剂瓶等进行清洗和消毒。使用新鲜的培养皿和试剂，确保它们没有受到黑胶虫的污染。细胞线消毒：对受黑胶虫污染的细胞系进行消毒处理，使用合适的消毒剂和方法，如特定的抗生素、或商业化的黑胶虫消毒试剂。请务必按照厂家提供的指导进行操作。

Q：请问检测细胞凋亡时细胞能用胰酶消化吗？直接刮下来会有影响吗？

A1：在细胞凋亡检测中，保留细胞的完整性非常重要，以便准确测量细胞凋亡的标志物。直接使用胰酶消化细胞会导致细胞的形态和结构破坏，可能影响凋亡信号的检测。

相反，常见的细胞凋亡检测方法包括使用特定的染料（如荧光染料）或抗体来标记凋亡标志物，如DNA断裂和磷脂外翻。这些方法通常在细胞处于附着状态下进行，而不需要胰酶解离。

A2：可以用胰酶消化，直接划下来可能会破坏细胞，造成细胞破裂

A3：不是不能用胰酶消化是不能用含有EDTA的胰酶消化，因为annexinV是Ca依赖的蛋白，所以不能加入EDTA，防止EDTA螯合了Ca离子从而影响annexinV，进而影响结果。所以你可以用不含EDTA的胰酶，放入温箱内进行消化，时间可以长一点，随时观察细胞情况，避免消化过度。建议用细胞刮子把细胞刮下来，然后用枪吹匀，比消化还简单，而且也避免了胰酶带来的损伤，机械的损伤还是很小的因为细胞大多呈大片大片地被刮下来。

A4：由于在细胞培养中，胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。胰酶作用时间过长、作用次数过多，都容易破坏细胞表面结构

用细胞刮也可以对贴壁细胞进行物理脱壁。使用时侧拿培养器皿，用无菌细胞刮沿一个方向转动挂，集于底部，直至刮完每一个角落即可。

另外，需要注意的是，在做细胞凋亡检测时，不适合用含有EDTA的胰酶，可以使用物理方法对细胞进行脱壁处理。Annexin V常用于细胞凋亡检测，是一种钙离子依赖的蛋白，EDTA会螯合钙离子从而影响Annexin V，进而影响结果，因此需选用不含EDTA的胰酶。