如何做好分子克隆

分子克隆作为基因工程的核心技术，可以通过改变基因组DNA序列，从而改变RNA和蛋白质，改变RNA和蛋白的功能。像构建过表达载体、异源表达载体、敲减载体、报告载体，以及crisp技术、同源重组技术等都属于分子克隆，分子克隆技术已经交叉渗透到生物学、医学等各个学科之中了。

分子克隆主要是围绕着中心法则，具体理解如下：

1. 过表达就是克隆特定基因编码区到强启动子载体上，再转染载体，使该基因表达增强的手段；
2. 点突变是通过改变基因上编码序列特定碱基，再克隆到强启动子上，转染后使其表达突变后的蛋白；
3. Crisp等敲除技术就是破坏DNA是中心法则从源头断链，导致蛋白无法表达；
4. shRNA和RNAi等就可以理解为中心法则的RNA被破坏，使蛋白表达降低了。

（上面这些只是教大家用中心法则去理解分子克隆技术，名词解释题可不能乱用）

常见的分子克隆类型：

1. 粘性末端克隆法

粘性末端克隆法，就是通过特定的酶将DNA片段和载体切出粘性末端，再通过连接、转化，筛选出克隆的方法；

2. TA克隆法

利用taq酶末端加A原理，将片段克隆到T载体上的方法；

由TA克隆延伸的克隆有TOPO TA克隆，

3. 同源重组法

利用重组酶将同源片段交换，使目的片段连接到载体上

同源重组法延伸的克隆有一步克隆法和Gateway克隆技术。

这几种克隆方式无优劣快慢之分，过程其实都差不多，至于效率就看你在构建过程中的细心程度了。粘性克隆酶切连接法，片段和载体都是自己制备的，而TA和同源重组法有很多商业化的载体，只需要自己扩增片段就行。