慢病毒载体和腺病毒载体，该怎么选？
Q：慢病毒载体和腺病毒载体，该怎么选？
A1：慢病毒载体转染效率高,可以构建稳定表达细胞系.但是,有可能发生重组的危险,所以要小心.
腺病毒载体做瞬时表达,转染较容易.但是,转染效率不高.
A2：不管是慢病毒载体还是腺病毒载体，都是很好的基因调控工具，各自有自己的优势，主要根据实验目的不同来选择，可以参考以下几个方面来判断：
（1） 插入目的序列的大小：慢病毒载体包装容量在2kb以内可以保证滴度，腺病毒包装容量在5kb以内可以保证滴度；若目的序列大小超过载体容量，滴度则会随着目的序列大小增加而降低；
（2） 是否需要构建稳转细胞株：慢病毒载体可以将外源基因随机整合到目的细胞基因组中并稳定遗传，即可用于构建稳转细胞株，当然做瞬时转染也可以；而腺病毒不整合基因组，只适用于瞬时转染；
（3） 目的细胞类型：像神经细胞、一些原代细胞等感染难度比较大的细胞，且后续无需建立稳转株，推荐使用腺病毒，其感染效率要远高于慢病毒。
Q：截短质粒做 co-ip 有没有可能出现所有截短都能够拉到目的分子，如果出现了可能的原因，阴性对照组的目的条带kd位置没有出现条带，这样是否可以排除为抗体在该位置可能存在非特异性结合？同样目的条带kd位置不是常见轻重链位置，全膜ip轻重链清晰可见，可以排除轻重链干扰。
A1：我也遇见过，而且我了解到其他人也遇到过。
我们的处理是:在加琼脂糖珠和抗体的时候，以及琼脂糖珠洗脱的各个步骤尽量细心一点，尽量保持每个样品加的试剂量一致，最后以拉到最少的那个截短质粒为准。
但是这样的结果存在假阳性，所以后面还需要做一些其他实验再次验证。
Q：AAV病毒用于细胞实验需要注意哪些问题？
A1：AAV病毒用于细胞实验关键注意事项
1. 启动子的选择。是选择广泛性启动子还是特异性启动子。相比于血清型的组织特异性，特异性启动子可实现细胞的特异性，因此对特异性要求较高的研究，可以选择某种细胞特异性表达的启动子。
2. 血清型的选择。AAV的血清型主要由AAV衣壳蛋白的结构所决定，不同的衣壳蛋白结构识别不同的细胞表面受体，因此血清型的选择会影响AAV的感染效率、组织亲和性、和开始表达的时间。
3. 病毒量及滴度。根据不同的靶器官组织和所使用的不同AAV血清型（扩散能力不同），推荐注射的AAV量不同，传递到组织中的病毒颗粒数量对于感染效果影响很大。但AAV使用量并不是越多越好，过多的量可能出现病毒溢出，而且根据我们的经验，病毒量太多有时候甚至会出现表达降低的情况。想了解具体组织的病毒用量可以联系我们咨询。
4. 注射方式。对于可以进行局部注射的组织器官，采用局部多点注射靶器官可取得较好的特异性和表达效果；
5. 检测时间。不同基因的表达高峰时间是不同的，再加上AAV需要从单链DNA变成双链DNA，一般在2周可检测到基因表达，如无抗体产生的影响，基因的表达可持续表达半年以上。
A2：虽然 AAV 病毒比其他多数病毒稳定（如慢病毒），但是也请避免反复冻融，否则将会导致病毒滴度显著下降。
1. 病毒使用前，操作人员应当充分了解病毒相关实验安全问题，加强安全操作意识。在实验操
作中，请务必穿戴好实验服、口罩、护目镜以及一次性手套。
2. 建议按照 BSL-2（Biosafety Level-2，生物安全防护二级水平）规范在 Class II 生物安全
柜中进行病毒操作（如在超净工作台中进行操作，请勿打开排风机，避免病毒与外界环境接触）。
3. 病毒操作时，请注意避免蛋白酶或细菌污染，请使用 DNase/RNase-Free 耗材进行操作。
4. 若眼睛、皮肤等不小心接触到病毒，请立即用大量清水冲洗；若病毒接触到伤口等部位，请
立即用 10% 碘伏溶液擦洗之后，用大量清水冲洗，冲洗时间建议至少 20min。
5. 实验结束后，请用新配制的 1% 的次氯酸钠溶液消杀病毒至少 20min；也可采用 2% 的戊二
醛溶液或 0.25% 的 SDS 溶液进行消杀处理，还可采用高温高压（121℃，1h）消杀措施。
A3：AAV做体外实验表达水平较低，主要因为常用的AAV病毒基因组是单链DNA，需要先复制成双链再转录翻译。AAV感染细胞后对细胞的分裂能力影响小，体外培养的细胞相对体内细胞分裂快，随着细胞分裂，细胞中的AAV呗稀释，也导致细胞实验中表达效率不高。
用AAV感染细胞时需要设置较高的moi值，这个值通常需要10^5vg/cell甚至更高，需要在正式实验前设置滴度进行摸索。
Q：为何有时病毒在体实验表达效率不理想？
A1：可能的原因为目的细胞不易感，属于难感染细胞，建议适当加大病毒量再尝试。
A2：首先，考虑病毒包装制备是否存在问题，比如外源基因是否正确，病毒滴度是否合格等。其次，考虑病毒运输和保存方式是否得当，解冻病毒一定要在冰上进行，尽量避免反复冻融，否则会影响病毒滴度；分装的病毒-4℃可以保存3天，-80℃保存半年以上需要重新测定滴度。
其次细胞良好的生长状态是达到高感染效率的保证，一般选择细胞形态较好、轮廓清晰、处于对数生长期的细胞进行感染可提高感染效率
A3：生物体内环境复杂，病毒感染细胞后，可能病毒可以很好感染细胞，但收到各种各样体内调控因素的影响，导致病毒携带的外源基因不表达或表达不理想，或表达水平不高。
另外还要考虑组织器官中基因本底表达水平，本底过高的基因要想实现高表达，或本地表达地的基因要实现低表达都可能比较困难。
Q：SDS-PAGE蛋白电泳实验，设置同样的电压，但是不同时间做，电流相差很大，有时不出带，为什么会出现这种情况？如何消除？
A1：可能和你电泳液的新旧程度有关。内槽放新配置电泳液，外槽放旧液。而且不出条带的话，也有可能是转膜的问题，转膜的时候也要关注电流电压的大小。
A2：可能与样品装载不均匀，凝胶浓度不同，缓冲液的ph或电流装置不良等相关，建议改善，保证每次实验条件相同。
A3：可能存在电泳缓冲液浓度过高或过稀情况，需要正确配置新鲜电泳缓冲液。
A4：电泳液和电转液的离子成分会影响电流电压。
丁香实验×安捷伦——细胞实验专场提问活动开始啦！
活动期间，在丁香实验小程序上抛出你的细胞实验问题，就能得到竹节杯、定制雨伞、U 盘等实物奖励，还可获得丁当虚拟奖励，可在丁香商城兑换心仪的礼品哦～
科研提问活动 · 细胞实验专场
活动时间：4 月 18 日～6 月 13 日
主题：细胞实验
（请先发布提问，再填写收货信息）
怎么才能获得这些奖励呢？轻松 2 步就能拿奖品
Step 1：
👉 方式一：直接进入丁香实验小程序，点击底部【我要提问】，提出你的细胞问题，关联细胞提问活动，即可。
👉 方式二：戳下方链接进入丁香实验问答广场，点击底部的蓝色按钮【我要提问】输入问题，选择关联「细胞领域」的实验，点击提交。
（点击大图查看提问指导）
Step 2：
等待自己的提问发布后，戳下方链接填写地址👇，坐等奖品到家，就这么简单！
【细胞实验提问活动规则】
①提交真实的细胞实验问题，并且通过审核，在前台发布，视为成功参与
②按照提问通过审核的个数，发放对应奖励。
-前 70 位提问者：可获得竹节杯 1 个
-前 20 位提交满 2 个问题：可获得定制雨伞 1 把
-前 10 位提交满 3 个问题：可获得U盘 1 个 ，先到先得，不可与定制雨伞兼得
备注：以上礼品不累加
③通过审核，符合奖励发放要求的，填写地址后 21 个工作日内统一邮寄
获奖名单公布链接：https://docs.qq.com/sheet/DRm9aaFdjZ1BIT0ZK?tab=BB08J2
欢迎大家将自己的提问，分享至自己的实验室群、学习群等科研人聚集地，帮助有相同实验问题的同学，一同查看解决方案哦～
举办活动的初衷是为了帮助大家解决科研实验问题，如果系统识别到恶意刷榜挤占榜单，非科研实验问题，一律不予发货哦，请大家公平参与！
有专家大牛坐镇，还能领取惊喜好礼，从现在起到 6 月 13 日都可以参与活动哦，快快来参加吧👇
*说明：
1、活动最终解释权，归丁香实验所有
2、所有活动数据公平公正公开，任何违规操作刷榜行为，一经发现，将取消活动参与资格，并封禁账号，请诚信参与活动
3、活动奖励，将在 6 月 13 日活动结束后 21 天内，统一安排寄送，请耐心等待
4、此次活动奖励：前 70 位发布提问可获得竹节杯 1 个；成功发布 2 个提问可获得定制雨伞 1 把；成功发布 3 个提问可获得U盘 1 个（先到先得，与 定制雨伞奖品不可兼得）。
最后编辑于 2023-05-30 · 浏览 844
