做 miRNA 的时候，不同组之间内参必须保持一致吗吗？
Q：请问各位PCR大佬，做miRNA的时候，不同组之间内参必须保持一致吗吗？
A1：不同组之间内参不用保持一致，但也不能差太多
A2：不同的内参相对定量结果不同，因此组间内参尽量保持一致。
A3：做miRNA时，不同组之间内参必须保持一致。
A4：必须一致。内参表达量一致，说明PCR的上样量一致，样本的质量也一致。如果出入很大，说明样本的浓度或者是质量有问题，测到的目的基因的表达量就不可靠了。
Q：可疑污染的细胞还能提取RNA吗
A1：视实验目的和污染类型而定。如果污染源对实验目的有干扰（比如假阳性或交叉污染等），就不能提取；如果污染源对所关注的实验对象无干扰，则可以提取。
A2：少量污染是可以提取的，大量污染很容易提取到细菌的rna，不容易分离
A3：最好不要，怕影响实验结果的准确性
A4：会带入细菌或者其它病原体的RNA，最好不要。
Q：在CDNA加入量和体积不变的话，10ul体系SYBR Green多加0.5ul是否对CT值有显著影响，结果是否可用
A1：如果在cDNA反应体系中多加了0.5 μl的SYBR Green，而总体系体积从10 μl变为10.5 μl，这个小误差通常不会对CT值产生显著影响，尤其是当你保持了cDNA的初始量不变时。
CT值是反应开始阶段，荧光信号的指数增加循环次数，用于定量PCR（qPCR）的数据分析。在这种情况下，只是SYBR Green的体积稍微增加，而cDNA的初始量和体积保持不变。因此，理论上来说，你的初始DNA含量应该没有改变，所以CT值应该不会受到显著影响。
然而，需要注意的是，这个小误差可能会在极少数样本中引入一些变异性。如果你的实验要求非常严格，或者需要准确的定量结果，建议重复实验并使用标准方法，确保实验操作的一致性和准确性。
总的来说，根据你的描述，只有SYBR Green体积稍微多加了0.5 μl，而cDNA的初始量没有改变，你的实验结果应该是可用的，尤其是对于初步的数据分析和趋势观察。
A2：应该问题不大，因为你计算的是样品相对于内参的相对值，SYBR Green加到了导致样品的Ct值变了，内参的相应也变了，所以可能计算结果影响不大。
Q：斑点杂交膜颜色很紫很紫是什么原因
A1：洗脱的时间不够吧，延长洗脱时间看看
Q：为什么ppic9k转入GS115的时候，要用通用引物来验证呢，用目的基因的特异性引物
A1：在将pPIC9K质粒转入GS115酵母细胞中，通常使用通用引物进行验证的原因是确保质粒成功转入细胞，并且在细胞中进行了稳定复制。这种验证方法可以确认质粒的整合和存在，而不依赖于特定目的基因的引物。
使用目的基因的特异性引物进行验证是更直接和具体的方法，可以验证目的基因是否被成功表达。这种方法可以提供关于目的基因表达的信息，但并不提供关于质粒整合和存在的信息。
因此，在pPIC9K转入GS115酵母细胞时，通常先使用通用引物进行验证，确保质粒成功转入并稳定存在，然后再使用特异性引物进行目的基因的特异性验证。这样可以确保质粒的整合和存在，并进一步确认目的基因的表达。
A2：因为测序前后各有几十bp是测不准的，特异性引物测不完整
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最后编辑于 2023-05-29 · 浏览 845
