PCR 产物后电泳孔里有很亮的条带是什么原因
Q：PCR产物后电泳孔里有很亮的条带是什么原因
A1：可能是分子量很大的产物，没跑下来
A2：PCR产物后电泳孔里有很亮的条带说明有污染了。
A3：当在PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳后，在孔口处出现很亮的条带，可能是由于以下原因之一：
1. 异源污染：很亮的条带可能是由于PCR反应体系中的异源DNA污染引起的。这可能来自其他PCR产物、外源DNA、引物、试剂或实验室环境中的DNA。在PCR实验中，特别是在DNA扩增前和反应制备中，严格的无菌操作至关重要，以减少异源污染的可能性。
2. 异常扩增产物：很亮的条带可能是由于非特异性扩增或其他PCR异常产物导致的。这可能是由于引物的非特异性结合、模板DNA的异质性、PCR条件不理想等原因。尝试优化PCR反应条件，包括温度、引物浓度和循环数等，以获得更特异的PCR产物。
3. 引物二聚体：很亮的条带可能是由于引物之间的二聚体形成引起的。引物二聚体是指引物之间的非特异性结合，可能导致在PCR反应中形成额外的产物。检查引物设计，并优化引物浓度，以减少引物二聚体的形成。
如果很亮的条带影响到实验结果的准确性，建议采取以下措施：
1. 检查实验条件：仔细检查PCR反应的各项条件，包括温度、引物浓度、循环数和反应体系成分等。确保这些条件符合实验设计的要求，并根据需要进行优化。
2. 引物设计和验证：确保引物的设计合理，并在实验之前进行验证。使用特异性高的引物，可以帮助减少非特异性扩增和异常产物的生成。
3. 实验室操作和无菌技术：在实验室操作中，严格遵守无菌技术，包括使用无菌工作台、无菌操作手套和经过消毒的试剂和仪器等，以减少异源污染的风险。
Q：实验设计需要将大肠杆菌基因组通过机械破碎（超声破碎)获得破碎的基因小片段，该如何设计
A1：以下是一个可能的实验设计方案：
1. 大肠杆菌培养和收获细胞：在LB培养基中培养大肠杆菌，直到细胞密度达到指定的值（如OD600 = 0.6）后，通过离心收获大肠杆菌细胞。
2. 菌体破碎：将收获的大肠杆菌细胞用PBS等缓冲液洗涤，离心去除菌体培养基等残留物。将菌体加入冰冻的研钵中，用超声波破碎仪进行破碎处理，将大肠杆菌基因组打断成小片段。破碎条件需要根据实验需要和设备特性进行优化，例如破碎时间、功率、温度等。
3. DNA提取：将破碎后的菌体混合物通过离心除去细胞壁和细胞膜等残留物，并使用DNA提取试剂盒等方法提取DNA。
4. DNA检测：通过琼脂糖凝胶电泳、紫外线分光光度计等方法检测DNA的纯度和浓度。
A2：设计大肠杆菌基因组的机械破碎实验需要考虑以下几个关键因素：
1. 超声破碎条件：超声破碎是一种常用的方法，但具体的操作条件需要根据实验要求进行优化。您可以尝试不同的超声功率、震荡时间和破碎温度等条件来确定最佳的破碎效果。
2. 破碎模式：根据您的需求，可以选择连续模式或脉冲模式的超声破碎。连续模式适用于较长时间的破碎，而脉冲模式可以用于较短时间的破碎。根据需要进行优化。
3. 样本处理：在进行超声破碎之前，您需要适当处理大肠杆菌细胞，如洗涤、离心等，以获得干净的细胞沉淀。同时，为了最大限度地保存基因组DNA的完整性，可以考虑在低温或冰上进行样品处理。
4. 碎片大小选择：根据您研究的需要，可以选择适当的超声破碎时间和功率来获得所需的碎片大小范围。较短的破碎时间和较低的功率可能产生较小的碎片，而较长的破碎时间和较高的功率可能产生较大的碎片。
5. 样品处理控制：在超声破碎后，您需要注意适当的样品处理控制，如快速冷冻或加入适当的缓冲液来保护破碎的基因片段，以避免降解或其他损伤。
Q：有没有老师同时跑P16和P21啊 内参是GAPDH 想问问电泳和转膜条件 跑的时候P16挺成功的 但是P21一直出不来
我是上层胶80V跑出红色marker 然后转120V 等marker散开 停止电泳 转膜是恒流300mA 30min 封闭1小时 一抗4度过夜 二抗室温摇床1小时
A1：p21分子量比较小，建议你可以采用过夜转膜的方法，比如说45伏转膜15h。marker分开前可以用65v电泳。
A2：其它抗体都出来了，而且p21的分子量不大也不是特别小，电泳和转膜应该没有问题，优化一下抗体的条件吧。
Q：wb检测细菌提取的蛋白，成像时maker显色了，可能哪里出问题了呢？
A1：绝大多是因为和2抗交叉反应导致形成的。
A2：WB检测过程中，如果胶上的marker显色了，可能的问题包括：
1. 染色步骤出现问题：通常情况下，标记蛋白不应当在成像过程中显色。如果这一步出现问题，可能是因为你在染色步骤中误用了某种试剂。
2. 二抗选择问题：如果使用了对所有蛋白都有反应的二抗（如抗鼠IgG二抗），可能会导致Marker也被二抗识别，从而在显色时出现颜色。
3. 非特异性结合：这可能发生在预混了二抗和标记蛋白的情况下。
解决这个问题，你可以首先确认你的染色步骤和所用试剂是否正确，然后检查你的二抗是否具有过高的非特异性，或者试着换一个二抗。最后，确保在转膜步骤和封闭步骤中充分洗涤，以避免非特异性结合。
A3：marker显色可能是marker加得太多了，或者目的蛋白表达太低。
A4：排查下mark有没有保存不当。
A5：可能是有蛋白污染了，建议去除污染源。
Q：请问流式检测细胞凋亡，统计分析是算的早期凋亡还是总的凋亡率？
A1：流式细胞仪常用来检测细胞凋亡，其中常用的方法是Annexin V和PI（丙啶碘）双染色。根据细胞凋亡的早晚阶段，细胞可以被分为三类：
1. 正常活细胞：Annexin V阴性，PI阴性
2. 早期凋亡细胞：Annexin V阳性，PI阴性
3. 晚期凋亡细胞或坏死细胞：Annexin V阳性，PI阳性
因此，当你在做统计分析的时候，你可以选择计算早期凋亡率（仅计算Annexin V阳性，PI阴性的细胞比例），也可以计算总的凋亡率（计算Annexin V阳性的细胞比例，不论PI的阴阳性）。
通常在一项实验中，我们可能同时关注早期和总的凋亡率，因为这两个数值可以给我们提供关于细胞凋亡进程的全面信息。
A2：一般是计算早凋加上晚凋，如果早凋特别显著你也可以单独拿出来分析
A3：统计分析时候算的是总的凋亡率。
A4：算总的凋亡率，不光是早期凋亡率
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最后编辑于 2023-05-24 · 浏览 3918
