wb 检测细菌提取的蛋白，成像时 maker 显色了，可能哪里出问题了呢？
Q：wb 检测细菌提取的蛋白，成像时 maker 显色了，可能哪里出问题了呢？
A1：绝大多是因为和2抗交叉反应导致形成的。
A2：WB检测过程中，如果胶上的marker显色了，可能的问题包括：
1. 染色步骤出现问题：通常情况下，标记蛋白不应当在成像过程中显色。如果这一步出现问题，可能是因为你在染色步骤中误用了某种试剂。
2. 二抗选择问题：如果使用了对所有蛋白都有反应的二抗（如抗鼠IgG二抗），可能会导致Marker也被二抗识别，从而在显色时出现颜色。
3. 非特异性结合：这可能发生在预混了二抗和标记蛋白的情况下。
解决这个问题，你可以首先确认你的染色步骤和所用试剂是否正确，然后检查你的二抗是否具有过高的非特异性，或者试着换一个二抗。最后，确保在转膜步骤和封闭步骤中充分洗涤，以避免非特异性结合。
A3：marker显色可能是marker加得太多了，或者目的蛋白表达太低。
A4：排查下mark有没有保存不当。
A5：可能是有蛋白污染了，建议去除污染源。
Q：请问流式检测细胞凋亡，统计分析是算的早期凋亡还是总的凋亡率？
A1：流式细胞仪常用来检测细胞凋亡，其中常用的方法是Annexin V和PI（丙啶碘）双染色。根据细胞凋亡的早晚阶段，细胞可以被分为三类：
1. 正常活细胞：Annexin V阴性，PI阴性
2. 早期凋亡细胞：Annexin V阳性，PI阴性
3. 晚期凋亡细胞或坏死细胞：Annexin V阳性，PI阳性
因此，当你在做统计分析的时候，你可以选择计算早期凋亡率（仅计算Annexin V阳性，PI阴性的细胞比例），也可以计算总的凋亡率（计算Annexin V阳性的细胞比例，不论PI的阴阳性）。
通常在一项实验中，我们可能同时关注早期和总的凋亡率，因为这两个数值可以给我们提供关于细胞凋亡进程的全面信息。
A2：一般是计算早凋加上晚凋，如果早凋特别显著你也可以单独拿出来分析
A3：统计分析时候算的是总的凋亡率。
Q：请问各位大神，在做一个meta分析，已知干预后的mean SD和t,p 应该怎么算干预前后差值
A1：在Excel，只要根据自己需要的换算类型，选择相应的sheet。所有换算过程，只需在绿色区域输入已知参数，即可在红色区域得到目标值，用EXCEL或者R软件函数求
A2：如果您已经获得了干预前和干预后的均值（mean）、标准差（SD）以及相关的t值和p值，可以使用以下方法计算干预前后的差值：
1. 根据t值和自由度计算效应量（Cohen’s d）：
• 从t值中提取效应量（d）：d = t * sqrt((n1 + n2) / (n1 * n2))
• 其中，n1和n2分别表示干预前和干预后的样本量。
2. 根据效应量和标准差计算干预前后的差值：
• 差值（delta）= d * sqrt((SD1^2 + SD2^2) / 2)
• 其中，SD1和SD2分别表示干预前和干预后的标准差。
请注意，以上计算方法是一种常用的计算差值的方法，适用于在Meta分析中合并研究结果。然而，具体的计算方法可能会因研究设计和数据的特点而有所不同。
Q：我的蛋白计算大小差不多是15kda左右 然后用镍柱纯化，跑出来25kda左右的条带是为啥啊
A1：有可能是你的蛋白mark不准导致的
A2：可能是形成聚合体了，所以跑出来的蛋白比较大
A3：如果您在使用镍柱进行蛋白纯化时，发现蛋白的分子量与预期大小相差较大，可能存在以下几个可能的原因：
1. 构建蛋白的融合标签：如果您在目标蛋白上使用了融合标签，如His标签，这些标签的分子量会增加到蛋白的总分子量中，导致跑出的条带分子量大于预期大小。确保您考虑了融合标签对分子量的影响。
2. 蛋白的构象或修饰：蛋白的构象或修饰状态可能会导致其在SDS-PAGE凝胶中迁移的速率发生变化，进而影响分子量的估计。某些构象或修饰可能导致蛋白在凝胶中呈现较大的移动率。
3. 蛋白的聚合状态：蛋白可能存在聚集现象，形成聚合物或复合物，从而导致其在SDS-PAGE凝胶中显示较大的分子量。聚合物的形成可能受到蛋白浓度、缓冲条件或其他实验条件的影响。
4. 凝胶电场或迁移条件：不正确的凝胶电场或迁移条件可能导致分子量的不准确估计。确保您使用正确的凝胶百分比、电场条件和迁移时间，以获得更准确的分子量估计。
5. SDS-PAGE标准品：确保您使用了适当的分子量标准品作为参照物，以便准确估计目标蛋白的分子量。校正分子量可能有助于更准确地确定蛋白的实际大小。
Q：USP20抑制剂GSK2643943A，加入在过表达的USP20中后，提蛋白后做WB，显示加入抑制剂组的USP29蛋白增加。这是哪里出了问题啊
A1：考虑是蛋白间存在相互作用，建议增加对照组。
A2：这可能由以下几个原因引起：
1. 蛋白间相互作用：USP20和USP29可能存在相互作用，而USP20抑制剂的加入可能会影响它们之间的相互作用。这可能导致USP29在抑制剂存在的条件下被释放或稳定，从而导致其在WB分析中的增加。
2. 反馈机制：USP20和USP29可能参与共同的调控途径或反馈机制。抑制USP20可能会导致反馈调节机制的激活，从而导致USP29表达增加。
3. 特定细胞系或条件下的反应：不同的细胞系或实验条件下，USP20抑制剂可能会产生不同的效应。特定的细胞类型、环境条件和实验处理可能导致USP29蛋白的增加。
4. 技术问题：在WB分析中，可能存在技术问题导致结果的误解。例如，抗体的特异性和特异性标记可能会影响到观察到的信号。确保使用特异性良好的抗体，并验证抗体的特异性和效果。
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最后编辑于 2023-05-22 · 浏览 2185
