protocol 分享｜离心柱法提取 DNA
简介
用离心柱法来提取 DNA，得到的 DNA 质量好，纯度和浓度较高。
原理
离心柱上有硅胶滤膜，在高盐低 pH 条件下，核酸能结合到硅胶膜上，而蛋白质和其他代谢产物被洗脱；后续改变反应条件到低盐高 pH 来洗脱纯化 DNA。
用途
用于 DNA 的提取。
材料与仪器
需要提取 DNA 的样本（血液/细胞/组织 DNA），蛋白酶 K，天根 DNA 提取试剂盒（货号：DP304），无水乙醇、离心机等。
步骤
1、平衡液预处理
取一个新的吸附柱放在收集管中，悬空加入 100 μL 的平衡液至离心柱中，12 000 rpm 离心 1 min，倒掉收集管中的废液，将离心柱放回收集管中，备用。
2、处理材料
（1）如提取材料为血液，可直接使用 200 μL 新鲜、冷冻或加入各种抗凝剂的血液，不足 200 μL 可加缓冲液 1 补足；
（2）贴壁培养的细胞和动物组织应先处理为细胞悬液，然后 10 000 rpm 离心 1 min，弃上清，加 200 μL 缓冲液，振荡至彻底悬浮；
3、加入蛋白酶 K，混匀
（1）提取血液和细胞基因组时，只需加入蛋白酶 K 混匀，即可继续进行下一步；
（2）提取组织基因组时，加入蛋白酶 K 混匀，需在 56 ℃ 放置，直至组织溶解，12 000 rpm 离心 30 s 以去除管盖内壁的水珠，再进行下一步骤。
4、加入 200 μL 缓冲液 2，充分颠倒混匀，70 ℃ 放置 10 min，溶液应变清亮，12 000 rpm 离心 30 s 以去除管盖内壁的水珠。
5、加入 200 μL 无水乙醇，充分振荡混匀 15 s，此时可能会出现絮状沉淀，12 000 rpm 离心 30s 以去除管盖内壁的水珠。
6、将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱中（吸附柱放入收集管中），12 000 rpm 离心 30 s，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中。
7、向吸附柱中加入 500 μL 缓冲液 3（注意：使用前请确保已加入无水乙醇！）， 12 000 rpm 离心 30 s，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中。
8、向吸附柱中加入 600 μL 漂洗液（注意：使用前请确保已加入无水乙醇！），离心 30 s，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中。
9、重复操作步骤 8。
10、将吸附柱放回收集管中，12 000 rpm 离心 2 min，尽量去除漂洗液，将吸附柱置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
11、将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位加 50~100 μL 洗脱液，室温放置 3~5 min， 12 000 rpm 离心 2 min；将得到的溶液重新放回吸附柱中，室温放置 2 分钟，12 000 rpm 离心 2 min，收集 DNA 溶液。
12、DNA 可以存放在 2~8 ℃，若要长时间存放，可以放置在 -20 ℃。
注意事项
1、所有的离心步骤均在室温完成，均使用台式离心机；
2、使用前确保缓冲液 3 和漂洗液中预先加入无水乙醇；
3、实验前将需要的水浴先预热到 70 ℃ 备用；
4、第 10 步，要让漂洗液挥发干净，否则会影响后续的实验；
5、样品需要避免反复冻融，否则会影响 DNA 的得率。
常见问题
1、最终没得到 DNA，可能是缓冲液 3 和漂洗液中没有加入无水乙醇；
2、DNA 得率低，可能是样本不新鲜或者样本经过反复冻融。
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最后编辑于 2023-05-22 · 浏览 1970
