快报 | 抗结核病的记忆性T细胞群的二次应答和维持：对结核病疫苗设计的启发

作者：刘欣，李浩然，李姗姗，袁金锋，逄宇

第一作者及单位：刘欣和李浩然，首都医科大学附属北京胸科医院/北京结核病与胸部肿瘤研究所细菌免疫室

通信作者及单位：袁金锋和逄宇，首都医科大学附属北京胸科医院/北京结核病与胸部肿瘤研究所细菌免疫室

Maintenance and recall of memory T cell populations against tuberculosis: Implications for vaccine design

Xin Liu, Haoran Li, Shanshan Li, Jinfeng Yuan, Yu Pang

Front Immunol，2023，14:1100741.

doi: 10.3389/fimmu.2023.1100741.

PMID: 37063832.

研究背景

尽管标准化抗结核药物治疗方案、先进的诊断方法和卡介苗 (Bacillus Calmette-Guerin vaccnie, BCG) 得到广泛使用，但全球结核病（tuberculosis，TB）流行仍然无法控制。为了应对这一挑战，迫切需要改进疫苗，以引发持久的免疫记忆，这是成功疫苗的标志。尽管如此，诱导和维持免疫记忆的过程尚不完全清楚。阐明记忆T细胞是如何产生和长期存活的，可能是开发有效的T细胞靶向疫苗的关键一步。在这里，我们总结了关于记忆T细胞反应的研究结果，该反应涉及诱导几个不同的记忆T细胞亚群，这些亚群是宿主有效抑制结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）活性所必需的。我们还总结了MTB感染宿主对T细胞介导的免疫反应阻碍的最新知识进展，并讨论了新型结核病候选疫苗的优缺点。

效应性T细胞和记忆性T 细胞的产生

T细胞免疫应答在介导适应性免疫以控制和根除外来病原体方面起着关键作用。感染最初引起宿主T细胞免疫反应后，会发生3个主要事件。首先，树突状细胞（dendritic cells, DC）和巨噬细胞充当经典的抗原呈递细胞（antigen-presenting cells, APC）。需要APC将复杂的蛋白质抗原转化为抗原肽，这些抗原肽可以与主要组织相容性复合物（major histocompatibility complex, MHC）I或II蛋白结合，形成细胞内MHC I或MHC II蛋白-抗原复合物。随后，这些MHC抗原复合物迁移到APC表面，与T细胞表面上的T细胞受体（T cell receptors, TCR）特异性结合，将抗原呈递给T细胞。MHC-抗原复合物与TCR之间的相互作用触发了T细胞信号传导，激活了幼稚T细胞增殖并分化为具有抗病原体功能的效应T细胞。接下来，效应T细胞通过两种机制对抗细胞内病原体：通过直接杀死受感染的细胞和通过产生细胞因子来激活其他类型的效应细胞以杀死和去除感染的细胞和抗原刺激。此后，在缺乏抗原刺激的情况下，大多数效应T细胞发生凋亡，导致它们从宿主组织中被去除，这是机体防止过度炎症反应的机制。效应T细胞库的这种克隆收缩似乎是由于抗原刺激和未刺激的效应T细胞上的低细胞因子受体水平而产生的促生存细胞因子的丢失。然而，一些效应T细胞存活并分化为记忆性T细胞 (memory T cell, Tm)（图1）。因此，免疫记忆的有效产生取决于两个极其重要的标准：分化成效应细胞的幼稚T细胞的数量和分化成Tm细胞的效应T细胞的数量。在整个生命过程中，宿主T细胞在数量和功能上会发生与年龄相关的显著变化，这些变化根据生命阶段而变化。在儿童时期，幼稚的T细胞会遇到大量独特的抗原，这些抗原会引发大量的抗原特异性T细胞扩增，然后持续产生和快速积累Tm细胞。重要的是，抗原多样性在成年期持续影响宿主免疫反应的形成，此时Tm细胞积累减慢并达到平台期。此后，Tm群进入长期稳态状态，与儿童时期相比，成人的病原体易感性下降。然而，在生命的后期阶段，Tm细胞稳态减慢，导致Tm细胞亚群的比例和功能发生变化， Tm细胞进入衰老、炎症反应性增加和细胞功能下降的状态。值得注意的是，活化的T细胞活性（TCR信号强度和持续时间、代谢活性、细胞因子释放和转录因子表达）都会影响T细胞一生的发育。

注 感染后，幼稚T细胞识别MTB抗原并分化为效应T细胞以控制细菌的生长。一些效应T细胞成为Tm细胞，提供长期保护，防止再次感染。Tm细胞的4个主要亚群分别为TCM、TEM、TRM和TSCM

图1  MTB在对结核病的免疫反应中与宿主T细胞和Tm细胞亚群相互作用

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记忆T细胞亚群的描述及其对结核病疫苗设计的影响

根据细胞表面标志物和关键功能特征，Tm细胞可以分为不同的亚群，包括中央记忆T细胞（central memory T cell, TCM）、效应记忆T细胞（effector memory, TEM）和组织驻留记忆（tissue-resident memory, TRM）T细胞（表1）。TCM是组成型表达CCR7和CD62L的CD45RO⁺记忆细胞，而TEM缺乏组成型CCR7和CD62L表达，并迁移到感染的外周组织以发挥即时保护作用。重要的是，反应性记忆是由TCM介导的，TCM存在于次级淋巴器官的T细胞区域，几乎没有效应功能。然而，当暴露于外来抗原时，这些细胞能够增殖并迅速分化为效应细胞。因此，TCM可以为宿主提供针对病原体入侵的长期保护，而TEM细胞只能提供短期保护。

表1 记忆性T 细胞亚群

TRM驻留在外周组织（例如肺）中，提供局部保护以防止再次感染。TRM与循环Tm细胞的区别在于其CD69和CD103分子的高水平细胞表面表达，而它们的功能和转录表达谱类似于TCM和TEM细胞的相应特征。重要的是，产生肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）、白细胞介素2（interleukin-2, IL-2）和IL-17的TRM在MTB感染的肺组织中快速增殖，同时在MTB感染模型中加入外源性IL-17或IL-2已被证明可以增强抗MTB免疫反应。综上所述，这些观察结果突出了TRM在MTB感染控制中发挥的重要作用。此外，MTB对宿主组织的侵袭触发了TRM细胞对感染的快速反应，从而激活了TRM效应功能，Bull等发现BCG疫苗接种导致CD4⁺ TRM细胞在肺组织血管内停留时间延长，在接种后的至少12个月内仍能在肺组织中检测到染色的CD4⁺ TRM细胞。

尽管TRM细胞可清除入侵病原体，但这些细胞产生的促炎物质可能会损害正常细胞，导致哮喘和（或）纤维化。因此，即使疫苗可以设计成增加宿主产生大量TRM，这些TRM可能在局部起作用以预防肺部感染，但必须特别注意确保这些疫苗不会诱导TRM过量产生。

T记忆干细胞（T memory stem cells, TSCM）是在人类和小鼠中发现的一种新型记忆T细胞亚群。最初是研究人员观察到有一群细胞在异体宿主中重复移植后可以维持移植物抗宿主病。研究随后发现这种“干细胞样”特性是由于它们的高增殖能力和通过自我更新持续维持其种群规模的能力。此外，观察到TSCM可分化成其他T细胞亚群，包括TCM和TEM。重要的是，由MTB感染诱导的抗原特异性CD4⁺ TSCM已被证明具有效应功能，包括各种Th1细胞因子的分泌和趋化因子受体的表达。TSCM最引人注目和独特的特征是它们能够不断自我更新并且分化成TCM或TEM。因此，TSCM有望作为预防和治疗工具，用于治疗疾病并提供针对各种疾病（包括肿瘤和感染）的长期保护。

为了应对不同的挑战，目前与Tm人群相关的知识可能有助于解释BCG在儿童与成人中的不同疗效。首先，儿童BCG疫苗接种诱导产生大量的TEM，似乎可以提供10~15年的结核病保护，实验证明小鼠接种BCG疫苗后增加了肺组织中的TEM数量。其次，儿童期是Tm细胞生成的关键时期，因为婴儿出生后不久接种BCG疫苗可以诱导产生大量抗原特异性Tm细胞，对MTB感染具有保护活性。然而，在整个生命过程中，环境MTB暴露会不断耗尽Tm库，最终削弱BCG疫苗诱导的对活动性结核感染的保护作用。第三，BCG是一种活疫苗，含有可能与环境MTB共享抗原的生物体，因此对环境MTB的持续致敏可能会阻碍成人BCG疫苗接种诱导的结核病保护的发展。为了解决这一问题，研究人员开发了促进TCM生产的方法和药物，从而提高BCG的功效。其中一种方法需要用与ESX分泌系统（ESX 1-5）相关的蛋白质补充疫苗，ESX分泌系统是分枝杆菌和其他生物体中存在的专门的VII型分泌系统（T7SS）。重要的是，豚鼠和接种了含有MTB ESX-5的BCG的小鼠对致病力强的MTB菌株具有更强的抵抗力，在小鼠中发现这与感染组织中TCM的增加有关。此外，氯法齐明是一种亲脂性利米吩嗪抗生素，已被世界卫生组织推荐用作二线抗结核药物，在给予BCG疫苗接种的小鼠时表现出免疫调节特性。具体而言，氯法齐明已被证明可以扩大TCM群体以增强TCM反应，同时阻断TEM细胞表面Kv1.3钾通道以减少TEM细胞数量。最终，这些效应增加了TCM∶ TEM比率以提高疫苗功效

MTB感染引起的T细胞免疫应答

MTB感染可以有效地诱导CD4⁺和CD8⁺ T细胞介导的抗菌反应。CD8⁺ T 细胞可以通过分泌穿孔素、颗粒酶和颗粒溶解素或通过参与细胞凋亡诱导的Fas-Fas配体相互作用来杀死MTB感染的细胞。然而，这些活动对感染的保护有限。相比之下，CD4⁺ T细胞通过分泌一系列细胞因子（如IFN-γ和TNF-α）来发挥其主要保护作用，这些细胞因子将其他免疫细胞吸引到感染部位，以促进几种CD4⁺ T细胞亚群分化为可以消除MTB的效应细胞。值得注意的是，Th1和Th17细胞是主要的抗结核效应CD4⁺ T细胞，其中Th1细胞通过参与IFN-γ的持续分泌而发挥保护作用，而Th17细胞则诱导中性粒细胞炎症，损害宿主组织。同时，调节性T细胞参与T细胞反应的负调节以防止过度炎症，而Th2细胞通过产生IL-4和IL-13介导体液免疫并促进抗炎反应。最终，机体需要不同T细胞类型之间的适当平衡，以支持TEM作为Tm和效应T细胞的来源，从而成功降低MTB负荷。这种平衡可以通过接种BCG疫苗接种来获得。

然而，在小鼠中进行的经典结核病研究表明，肺部MTB感染可以延迟宿主T细胞免疫反应。在最初的肺部感染后，APC从MTB感染的肺组织部位迁移到胸腔引流淋巴结，在那里它们将抗原呈递给幼稚的T细胞。随后，这些T细胞分化成效应T细胞，迁移到肺部以彻底清除感染部位的MTB。然而，MTB感染可以通过减缓这两个反应步骤的执行来延迟抗结核免疫应答：（1）APC从肺转运到淋巴结；（2）效应T细胞启动和运输到肺部。越来越多的证据表明，MTB在初次感染后的11~12 d即开始向纵隔淋巴结运输。然而，在感染的早期阶段，MTB通过抑制巨噬细胞凋亡和MTB抗原呈递来延迟细菌转运到淋巴结。反过来，Th1细胞的募集延迟导致T细胞启动受损和肺内趋化因子反应减少，从而为MTB复制提供了时间。这些结果表明，产生IFN-γ的CD4⁺ T细胞的肺组织定植率，而不是外周CD4⁺ T细胞群的大小，是保护性免疫的关键特征。

一旦吞噬细胞内的MTB从肺部运输到肺淋巴结，它们就会刺激MTB特异性Treg细胞的增殖。因此，即使肺部淋巴结内这些细胞的数量不多，也可以阻止效应T细胞发生启动，最终减少肺内启动的效应T细胞的积累。因此，上述情况可以解释延迟效应T细胞免疫应答如何使早期细菌生长，从而导致MTB感染宿主的细菌负荷增加。同时，MTB可以通过增加Treg细胞的数量来影响免疫抑制，从而干扰活动性结核病或潜伏感染患者的CD4⁺ T细胞功能和结核病控制。此外，MTB可以操纵宿主Th细胞极化，导致免疫反应从Th1反应转变为Th2反应。重要的是，Th2反应不能有效地维持对MTB生长的持续控制，从而使活动性结核病长期存在。或者，长期慢性感染和癌症可能会诱导T细胞持续表达抑制性细胞表面受体（如PD-1，TIM-3，LAG-3和CTLA-4），从而造成T细胞耗竭。T细胞耗竭是一种影响CD4⁺和CD8⁺ T细胞的效应T细胞功能降低的状态。慢性MTB感染期间发生的T细胞耗竭的特征是各种抑制性细胞表面受体表达升高和IL-2、IFN-γ和TNF-α的产生逐渐减少。因此，这些功能失调的T细胞失去了清除病原体的能力，无法提供有效的感染保护。此外，耗竭的CD4⁺ T细胞释放较少量的IFN-γ，而IFN-γ对控制MTB感染是至关重要的。最后，据报道，T细胞功能障碍与结核感染慢性期BCG疫苗效力减弱密切相关。癌症和结核病中T细胞衰竭的机制是相似的，这两种疾病都可能导致T细胞失去有效功能。为了克服肿瘤中的T细胞耗竭，研究人员已经提出了各种方法，包括检查点抑制剂和基于细胞因子的疗法。检查点抑制剂是一种阻断特定免疫检查点途径的免疫疗法，例如PD-1和CTLA-4。通过阻断这些途径，检查点抑制剂可以恢复T细胞功能并恢复它们攻击肿瘤细胞的能力。基于细胞因子的疗法，如IL-2、IL-7和IL-15，可以刺激T细胞的生长和活化，并有助于恢复其功能。为了治疗结核病中的T细胞耗竭，目前也正在开发各种方法，包括免疫调节药物，如IFN-γ和免疫检查点抑制剂。此外，也在探索联合疗法，例如使用抗生素和免疫疗法联合，作为恢复T细胞功能和改善治疗结果的一种方式。

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新型结核病疫苗的挑战和机遇

为了诱导长期免疫记忆以实现对MTB感染的保护，研究人员正在努力开发新的结核病预防疫苗，如全细胞疫苗和亚单位疫苗。尽管估计已有16种新的结核病候选疫苗进入临床试验（表2），但这些疫苗不太可能作为目前接种的BCG的有效替代品。在本文中，我们总结了新候选疫苗的优势，以及它们在开发改进疫苗方面的相关挑战和进展。目前正在开发两种可行的全细胞疫苗，即重组卡介苗（rBCG）疫苗和减毒活MTB疫苗。目前，MTBVAC（减毒活MTB疫苗）和VPM1002（rBCG疫苗）都已纳入临床试验，并已被证明比BCG疫苗接种更能引发更好的抗MTB免疫反应和对感染的保护。事实上，接种MTBVAC疫苗的婴儿表现出抗原特异性CD4⁺和Th1细胞介导的炎症反应，在接种疫苗后约2.5个月达到峰值，从而表明其诱导了持久的记忆反应，这种反应持续到疫苗接种后的12个月。此外，VPM1002可产生更高比例和数量的TCM细胞，能够提供比BCG疫苗更强的MTB感染保护。然而，由于它们与MTB的相似性，全细胞和BCG疫苗的有效性可以通过暴露于环境MTB的宿主预敏来降低。同时，其他因素可能导致疫苗效力降低，包括MTB进展延迟、慢性抗原诱导的炎症、Treg诱导和T细胞耗竭。由于全细胞疫苗中的活病原体可以在接种疫苗的接受者中持续数月甚至数年，由此产生的慢性抗原刺激可以促进炎症微环境的形成，可能倾向诱导Treg比例增加和发生T细胞耗竭。作为替代方案，通过黏膜途径接种的疫苗可以避免延迟的T细胞反应。大量的研究结果表明，与标准皮内免疫接种的疫苗相比，黏膜BCG疫苗可提供更强大的保护性免疫力。此外，与黏膜BCG疫苗相比，对恒河猴进行MTBVAC黏膜给药可使其具有更广泛的抗原特征和更强大的局部免疫力的免疫反应。虽然活的全细胞疫苗是有利的，因其可引发广谱免疫反应，但它们也可能引发不良的炎症反应，从而增加不良反应的风险。相比之下，亚单位疫苗的安全性要比活的全细胞疫苗高很多，亚单位疫苗是使用1种或几种抗原来产生抗原特异性免疫反应，并通过佐剂蛋白或病毒载体编码的蛋白质递送来实现增强免疫。大量证据表明，亚单位疫苗可以产生强大的免疫记忆和高比例的TCM和TRM细胞。目前，此类疫苗的设计是在接种BCG后再接种，以增加BCG介导的保护强度和免疫持续时间。然而，许多MTB抗原在感染的不同阶段具有独特的表达模式，这对亚单位疫苗设计提出了重大挑战，因为它们无法复制广泛的抗原表达。这一缺点与T细胞扩增不良有关，可导致低水平抗原表达，而一些疫苗诱导高水平的长期抗原表达已被证明会导致小鼠和人类CD4⁺ T细胞耗竭。然而，使用有效的佐剂亚单位疫苗可以通过将T细胞保持在受保护的、分化程度较低的状态来抵消高水平抗原驱动的T细胞耗竭。同时，许多MTB抗原在不同的MTB感染阶段独特表达，这些抗原可以掺入疫苗中，以在多个感染阶段产生更广泛的抗原特异性免疫力。为此，已经开发了两种非常有前途的重组融合蛋白亚单位疫苗M72 / AS01E和H5，用于保护成人免受肺结核感染，目前正在临床试验中进行评估。此类疫苗需要明矾等佐剂，明矾是目前亚单位疫苗中使用最广泛的佐剂。尽管如此，明矾主要增强体液免疫反应，而不是细胞免疫。因此，需要新的佐剂，使新的结核病亚单位疫苗能够诱导细胞介导的Th1型免疫应答。佐剂IC31，一种新型的基于TLR9激动剂的佐剂，可能适用于此目的。当IC31与H4抗原联合给药时，在注射后约两周可诱导强大的H4特异性IFN-γ反应。同时，脂质体佐剂DMT与rRv0572c蛋白抗原的给药已被证明可以增强BCG免疫原性以防止潜伏感染再激活。此外，使用CAF01作为佐剂的H1疫苗已被证明可产生显著的抗原特异性T细胞反应，这些反应在3年后仍可检测到，从而证明可以在疫苗接种者中建立针对MTB的持久免疫记忆。或者，病毒载体可以成功地将抗原编码基因递送到宿主细胞中，以诱导T细胞介导的免疫，而无需佐剂。例如，MVA85A是一种递送Ag85A抗原的改良MVA病毒，是一种有前途的载体候选疫苗，目前正在临床试验中进行评估。MVA85A可促进TCM和TEM的产生，并显著增强健康人类受试者的长期T细胞反应。然而，最近一项针对MVA85A的IIb期试验表明，这种疫苗引发的持久免疫记忆无法增强BCG诱导的婴儿结核病保护作用。此外，对于佐剂蛋白疫苗，病毒载体疫苗可能无法提供合适的抗原剂量，因为它们具有高水平的免疫原性，这往往会驱动T细胞的终末分化。因此，病毒载体疫苗诱导的TCM比例可能低于佐剂蛋白疫苗产生的TCM比例。

表2 进入临床试验的结核候选疫苗

研究结论

疫苗接种是实现感染预防和控制的最有效干预措施之一。传统T细胞亚群（CD4⁺ T细胞和CD8⁺ T细胞）在治疗MTB感染中的重要性已得到充分认可，但MTB疫苗的功效在很大程度上取决于Tm细胞介导的免疫记忆。本文进一步论证了Tm细胞介导的免疫应答在抗结核过程中的确切作用，总结了增加T细胞亚群数量的有效途径，为开发有效的新型疫苗提供了理论依据。

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