论著 | miR-99a-5p在结核分枝杆菌感染宿主巨噬细胞中的免疫调控作用

作者：史雨婷¹ 董静¹ 贾红彦¹ 朱传智¹ 杨斌² 李自慧¹ 孙琦¹  杜博平¹ 邢爱英¹ 张宗德¹ 潘丽萍¹ 

作者单位：¹ 首都医科大学附属北京胸科医院/北京市结核病胸部肿瘤研究所耐药结核病研究北京市重点实验室， 北京 101149；² 首都医科大学附属北京胸科医院/北京市结核病胸部肿瘤研究所肿瘤研究中心， 北京 101149

通信作者：潘丽萍，Email：panliping2006@163.com

基金项目：国家自然科学基金(81902024；82172279；82070012)；北京市自然科学基金(7192038；7212012)；通州区运河计划人才项目(YH201807；YH202001)；北京市医院管理中心青年职工创新工作室-创新梦工场(202136)

来源：中国防痨杂志，2023，45，(5)：464-471.

doi：10.19982/j.issn.1000-6621.20220532

摘要

   目的：初步探讨结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis， MTB)感染THP-1细胞内特异miRNA在宿主抗结核免疫中的作用。方法：提取MTB感染及未感染THP-1细胞RNA，基于Illumina NovaSeq6000二代测序平台检测THP-1细胞内miRNA表达谱。采集4名健康受试者6ml外周血并分离人原代巨噬细胞。应用实时荧光PCR(qRT-PCR)技术验证MTB感染THP-1细胞内特异miRNA并检测人原代巨噬细胞中靶标miRNA的表达水平。构建miRNA过表达载体，经慢病毒转染THP-1巨噬细胞获得稳定的过表达细胞株，使用qRT-PCR检测H37Rv感染的miRNA过表达细胞及对照空载体细胞中的肿瘤坏死因子α(TNF-α)及γ-干扰素(IFN-γ)表达水平。结果：从16个二代测序结果表达差异明显的miRNA分子中选取既往未作研究且差异最为明显的miR-99a-5p(P=0.021)作为研究靶基因。通过qRT-PCR在THP-1细胞及原代巨噬细胞中验证，发现miR-99a-5p在THP-1感染组和原代巨噬细胞内的表达量(分别为0.482±0.148和0.433±0.072)均明显低于未感染组(1.536±0.290和1.113±0.218)，差异均有统计学意义(t=6.476，P＜0.001；t=3.167， P=0.019)。MTB感染miR-99a-5p过表达细胞后24h的菌落形成单位(CFU)[64.0×10⁴(52.0×10⁴，87.0×10⁴)]明显高于MTB感染的对照空载体细胞内CFU[17.0×104(16.0×10⁴，24.0×10⁴)]，差异有统计学意义(Z=-2.323， P=0.029)。与MTB感染的对照空载体细胞相比，MTB感染的miR-99a-5p过表达细胞内TNF-α及IFN-γ的mRNA相对表达水平分别由1.018±0.310和1.687±0.135下降至0.740±0.001和0.631±0.374，差异均有统计学意义(t=4.631， P=0.010；t=3.349， P=0.010)。结论：miR-99a-5p可抑制TNF-α及IFN-γ的释放，促进MTB在巨噬细胞内的生长。MTB感染后宿主miR-99a-5p的下调表达可能在宿主抗结核感染免疫中发挥重要作用。

   关键词：分枝杆菌，结核；芯片分析技术；微RNAs；巨噬细胞；免疫调节

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