求助IL-6表达 western blot

丁香实验

发布于 2023-05-16 · 浏览 1509 · IP 浙江浙江

这个帖子发布于 2 年零 3 天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。

👉前往【问答广场】

浏览更多实验问答

48 小时内有问必答~

Q：想问一下，纳米颗粒刺激了细胞白介素-6表达用ELISA测过细胞上清了，还需要用western blot测细胞内么，或者用pcr测细胞内IL-6，再或者测细胞内IL-6 上游STING的表达呢哪种方案合适呢。

A1：通常情况下，ELISA测定细胞上清中的IL-6是一个快速、定量的方法，可以提供有关细胞外IL-6的信息。如果你对细胞内的IL-6表达或特定信号通路感兴趣，可以选择Western blot或PCR进行更深入的分析。

Western blot测定细胞内的IL-6：Western blot是一种常用的蛋白质检测方法，可以用于检测特定蛋白在细胞内的表达水平。如果你对细胞内的IL-6表达水平感兴趣，可以使用Western blot来检测细胞内的IL-6蛋白质含量。

PCR测定细胞内IL-6 mRNA：如果你想了解细胞内IL-6基因的转录水平，可以使用实时定量聚合酶链反应（qPCR）来测定细胞内IL-6 mRNA的表达水平。这将提供关于IL-6基因转录的信息。

测定细胞内STING的表达：如果你对纳米颗粒刺激下游的信号通路感兴趣，如STING信号通路，可以使用Western blot或PCR来检测STING蛋白或mRNA的表达水平。

A2：三种方法都是可以的，可以选择pcr把上下游分子联系起来

Q：羧基微球标记抗体如何避免物理吸附

A1：羟基微球标记抗体可以通过化学共价键的方法来避免物理吸附。化学共价键的方法包括：羧基化、醛基化、硫酸化等。其中，醛基化是最常用的方法之一。

A2：去除抗体表面电荷，一般抗体物理吸附主要靠静电作用，中和电荷后可以有效避免物理吸附

A3：胶乳微球物理吸附反应微球带磺酸基、羧基、醛基表面的都是疏水微球，都可以用来设计被动吸附蛋白。基微球表面含带有负电荷的磺酸基团， pka大约为2，因此在酸性 pH 保持稳定。醛基微球表面也带有磺酸基团，但能和蛋白行程共价键。羧基微球表面含带负电荷的羧基基团，在 pH5.0 以上时保持稳定。带有疏水基团的蛋白的吸附和配位结合，是最简单和直接的标记方法。这种方法中，微球溶液和含目标蛋白的溶液混合，反应后，未结合的游离蛋白通过清洗步骤除去，从而获得胶体蛋白复合物。疏水吸附方法只能用于疏水微球(硫酸盐、羧基、醛基表面修饰的微球)。醛基表面修饰微球是一个特例，其疏水吸附结果取决于后来的共价结合。虽然物理吸附是不依赖pH的，但反应缓冲液的pH对蛋白的结构有非常大的影响，从而影响蛋白吸附到微球上的反应效率。一般，在被吸附蛋白等电点附近 pH时，物理吸附效率会很高。

A4：要避免羧基微球上的抗体物理吸附，可以采取以下措施：

1. 预处理微球：在将抗体与羧基微球结合之前，可以先对微球进行预处理。一种常用的方法是使用阻聚剂，例如牛血清蛋白（BSA）或非特异性蛋白质，预包覆微球表面。这样可以形成一层保护层，减少抗体与微球之间的非特异性吸附。

2. 优化工作液：在抗体结合过程中使用合适的工作液可以减少物理吸附。选择合适的缓冲液和添加剂，例如蛋白质阻聚剂、非离子型表面活性剂（如Tween-20）或胎牛血清等，可以减少非特异性吸附。

3. 控制pH值：适当的pH值也对减少物理吸附很重要。根据抗体和微球的特性，优化pH值可以减少吸附。通常，中性或稍微碱性的条件更有利于减少非特异性吸附。

4. 增加孵育时间：在抗体结合过程中，延长孵育时间可以增加抗体与微球的特异性结合，从而减少物理吸附的可能性。适当增加孵育时间，确保充分的结合反应。

5. 使用防吸附试剂：某些试剂可以用于减少蛋白质的非特异性吸附，例如聚乙二醇（PEG）。你可以尝试在抗体结合过程中添加适量的PEG或其他防吸附试剂来减少物理吸附。

Q：组织透明化方案很多，如何选择

A1：组织透明化方法主要分为三类：有机溶剂型、水溶剂型、水凝胶型，需要快速出结果一般选有机

A2：1. 油性组织透明化方法

油性组织透明化技术主要是应用含有高折射率介质的光学透明剂取代组织中水分和脂质来平衡组织折射率，使组织达到光学透明。油性组织透明化方法具有较强的透明化效果，但是组织中的荧光蛋白容易被破坏，信号保存度低。

2. 水性组织透明化方法

亲水性试剂透明主要包括：单纯浸泡透明和高水化脱脂透明。

浸泡型透明化技术是将样品浸泡在高折射率溶液中利用渗透压使组织逐渐透明化，该方法不去除脂质，利用高折射率溶液替换组织内外的液体，以平衡折射率，浸泡型透明化方法常适用于较小样本的透明化处理。ClearT是基于甲酰胺的浸泡型透明化方法，该方法透明速度快，成像效果好，但会使组织略微膨胀，且会使样本荧光信号淬灭。PEG可以稳定蛋白质构象，继而发展了可保留荧光蛋白的ClearT2的透明化技术，但该方法透明度比clearT低，透明化能力受限。SeeDB技术以果糖和硫代甘油为主要成分。能在几天内将样本透明化，且体积变化小，并可以与亲脂性染料兼容。但该方法因果糖黏度大导致在组织内的渗透性较低。由于SeeDB黏度极高，在SeeDB基础上衍生了FRUIT透明化方法，该方法选择尿素作为试剂中另一成分，降低了果糖黏度，大大提高试剂流动性和渗透性，加速了试剂在组织中的扩散速率。虽然浸泡型透明化操作比较简单方便，但浸泡型透明化方法不能去除脂质，因此通过该方法处理的样本透明度有限。

3. 水凝胶组织透明化方法

去垢剂可以高效的去除样本中的脂类物质，但是高浓度的去垢剂处理样本可能会使样本发生形变。通过将样本包埋在水凝胶中，使水凝胶与样本中的蛋白质和核酸分子形成共价连接便可固定和保护细胞结构，再将样本置于透明化试剂中即可避免样本发生这种形变。CLARITY透明化方法利用凝胶包埋样本，并利用电场力去除样本的脂质从而使样本快速透明。SHIELD透明化方法通过环氧化合物P3PE固定组织实现蛋白的保护，之后使用SDS进行被动或主动除脂。

油性透明化方法透明的样本透明度高，速度快，能适用于多种组织和器官。但是油性方法所使用的试剂大多毒性较强，并且容易淬灭内源性荧光蛋白的信号，不能和细胞膜上亲脂染料相兼容，样本会有明显收缩，组织或器官内部精确三维结构丢失。水性透明化方法虽然可以部分解决荧光蛋白易淬灭的问题，但是也存在透明时间长，透明能力低的缺点。水凝胶透明化方法操作过程复杂，且需要一定的设备。

A3：主要看组织的类型

目前组织透明化方法有油性，基于水凝胶和水性的组织透明化方法。可依靠组织的类型进行选择，脂肪类组织多选择油性，单细胞可选择水性等

Q：区分癌旁组织和癌组织可以实现活体上的定位么？还是现在只能组织切片

A1：区分癌旁组织和癌组织通常需要进行组织切片和病理学分析。这是目前常用的方法，可以通过显微镜观察和分析组织形态、细胞类型和病理变化来区分癌旁组织和癌组织。

在活体上进行组织定位是一项复杂的任务，需要先对组织进行成像，然后进行实时的分析和判断。尽管有一些医学影像技术如超声、CT、MRI等能够提供体内组织的影像信息，但通常无法直接区分癌旁组织和癌组织。这些影像技术主要用于检测异常区域和指导进一步的诊断和治疗。

对于特定类型的癌症，如胃癌、乳腺癌等，一些影像技术可能会提供一定的定位信息，但仍需要通过组织切片和病理学分析来最终确定组织的性质和癌变程度。

总的来说，目前在活体上直接定位和区分癌旁组织和癌组织仍然是一个挑战，需要通过组织切片和病理学分析来确诊。不过，随着技术的不断进步和新的研究方法的发展，未来可能会有更多的方法和技术用于实现活体组织的定位和鉴别。

A2：不可以，超声也只能推测，要想确诊还是要做切片

A3：目前不能活体分析，要做切片。

Q：如何提高desi-msi在组织精细结构中药物示踪的分辨率，喷雾溶剂的更换能否有效降低检测下限，如何实现对关注区域的定量分析

A1：要提高DESI-MSI)在组织精细结构中药物示踪的分辨率，可以考虑以下方法：

优化喷雾角度和距离：调整DESI喷雾器的角度和距离，使其与样品表面的接触更加均匀。通过优化喷雾角度和距离，可以改善药物在组织表面的分布和信号强度，从而提高分辨率。

优化喷雾溶剂组成：喷雾溶剂的组成对于DESI-MSI的性能至关重要。可以尝试不同类型的溶剂，如乙腈、甲醇、水等，以找到适合特定药物的最佳组合。溶剂的选择可能会影响药物在组织表面的溶解度、扩散性和离子化效率，进而影响药物信号的强度和分辨率。

优化DESI-MSI扫描参数：调整DESI-MSI的扫描参数，例如离子化电压、离子转移容积、离子化区域的大小等。通过优化这些参数，可以改善药物的离子化效率和传输效果，提高信号强度和分辨率。

为了实现对关注区域的定量分析，可以考虑以下方法：

标准曲线法：通过制备一系列已知浓度的标准样品，建立药物浓度与DESI-MSI信号强度之间的标准曲线。然后，根据关注区域的信号强度，可以通过标准曲线进行定量分析，估算出药物在关注区域中的浓度。

内标法：选择一个已知浓度的内标物，将其添加到样品中。内标物的信号强度可以作为相对于药物信号的参考，用于定量分析。内标物应具有与药物相似的性质和离子化效率，以确保准确的定量结果。

图像分析法：利用图像处理和分析软件，对DESI-MSI图像进行定量分析。可以通过测量药物的信号强度并与已知浓度的标准样品进行比较，来估算关注区域中药物的浓度。

A2：喷雾溶剂的更换是可以有效降低检测下限的。

A3：1. 对于目前的DESI XS接High Performance Sprayer来说，硬件部分没有需要调整的，通常的喷雾的流速是2ul/min，此时的空间分辨率约为20um。降低流速，比如降为1ul/min或0.5ul/min可能会进一步提高空间分辨率。对于旧的喷雾头来说，除了降低流速外，还需要旋转喷头达到最优的聚焦。2. 喷雾溶剂的更换是有必要试的，最基本的就是甲醇和水的比例，以及加甲酸、氨水或甲酸铵的比例，对提高目标物的响应有一定的效果。3. 定量分析可参考DESI有关文献。基本是做一个基质加标的标曲，用HDI中的ROI选定区域来计算响应值，做标曲。再选择待测样品的区域的ROI，代入标曲中定量。