重叠延伸pcr
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请友友们指教，我做重叠延伸pcr同时连接三个片段，我分成两步，第一步，三个片段以1:1:1的摩尔比做模板，50微升体系，不加引物，然后按照pcr的程序跑，设8-10个循环
第二步，往上一步的pcr管中加入上下游引物各1微升，然后继续pcr，最终是连上了，但是浓度低。第二步的时候我更改了下退火温度和延伸时间，我理解的是，在第一步结束之后，模板量会增加到200纳克以上，所以我延长了延伸时间，然后我的引物因为添加了酶切位点，Tm值较高，所以第二步反应时我提高了退火温度，请问我的体系和程序是否有什么问题？为啥浓度会低呢？有什么解决办法吗？
最后编辑于 2023-05-15 · 浏览 681
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