RNA pull-down 做 WB 结果不稳定

丁香实验

发布于 2023-05-08 · 浏览 2218 · IP 浙江浙江

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Q：最近在做RNA pull-down，下拉样品用于做WB，但实验结果不稳定，情况如下：针对目的蛋白，有时候反义链不结合，正义链结合；但有时候正义链和反义链都结合。请问哪位好友有遇到过相同情况吗？

A1：可能样品中的互作蛋白表达量很低或样品中存在杂蛋白。

A1：最大的可能性就是rna链中存在交叉结合的碱基，可以更换特异性强的引物

A3：对于RNA pull-down实验，出现反义链和正义链都结合的情况，可能是由于以下原因造成的：

RNA probe设计的问题：可能RNA probe的设计不够特异，存在交叉反应。此时可以重新设计probe，确保其特异性。

绑定条件不合适：可能RNA probe的绑定条件不够严格，导致了非特异性的结合。可以考虑增加绑定缓冲液的含盐量、调整温度和时间等条件，提高绑定的特异性。

绑定实验中存在干扰物：可能存在其他干扰物干扰了RNA probe的结合，如其他非特异性的RNA分子。可以尝试加入RNA酶来消除干扰物的影响。

WB检测条件不合适：可能WB检测条件存在问题，导致检测结果不稳定。可以考虑优化WB检测条件，如优化抗体浓度、缓冲液组成、膜的转移时间等条件。

另外，建议在实验过程中使用合适的阳性和阴性对照，以确保实验结果的准确性和可靠性。如果问题仍然存在，可以考虑尝试其他相关的实验方法进行检测和验证。

Q：求助各位大佬，细胞在体外倍增时间是11小时，在体内的被赠送时间是1.5天，把细胞体外培养一天等同于人体的一周，这是怎么换算的呢？

A1：将细胞在体外培养一天等同于人体内的一周，可以根据细胞在体内和体外的倍增时间进行换算。

假设细胞在体外的倍增时间为11小时，那么在一天内，该细胞可以经历24小时/11小时 ≈ 2.18次的倍增。

而在体内被赋予的时间为1.5天，那么该细胞在体内可以经历1.5天 × 2.18次 ≈ 3.27次的倍增。

因此，将细胞在体外培养一天等同于人体内的一周，可以认为细胞在体内可以经历3.27次的倍增，即人体内的一周大约等于细胞在体外培养3.27天。

A2：可以用公式（DT=t*[lg2/(lgNt-lgNo)]）计算。t为培养时间，No为首次记下的细胞数，Nt为t时间后的细胞数。一般No在接种细胞24小时后进行。体内与体外的细胞增殖曲线不同，得到的数据不同，需要分别计算后进行比较

Q：为啥同一个代谢物，在两次检测中，得到的编号不一样，m/z，rt 值不一样，不过两次送的样不完全一样，是不是这个原因影响的？

A1：除了实验条件的影响，结果最大的不同在于样品的不同，最好要保证样品一致，三次重复实验取均值，结果差异太大要舍去

A2：是的，同一个代谢物在两次检测中得到的编号不一样，m/z和RT值不一样，可能是由于两次送检的样品不完全一样导致的。质谱分析通常会受到样品制备、质量、保存和运输等因素的影响，这些因素可能会导致检测结果的差异可能会导致代谢产物的含量和组成发生变化从而影响其质谱特征此外，样品制备过程中的误差、仪器的精度和灵敏度等因素也可能会导致检测结果的差异因此，为了获得可靠的质谱分析结果，需要在制备样品和进行质谱分析前，严格控制实验条件，保证样品的一致性和可重复性。如果要对同一代谢物进行多次检测，建议在样品制备和质谱分析前尽可能保持样品的一致性，以减少实验误差和结果的差异。如果两次送检的样品不完全一样，则需要进行更加谨慎的数据解释和结果分析，以避免误判和误解。

A3：不同批次的样品会产生一定程度的差异，一般至少是送三次样品，然后会有p值等数据方便分析

A4：是的，要保证每次送样一样，实验条件一样才能得到理想的结果

Q：实验目的需要检测土壤中单独一种真菌的生物量，能否设计某种引物通过qpcr来特异性定量检测其dna含量，从而定量检测其生物量。如果可以的话，整个实验的难点在哪里，最耗时的是哪一块，整个实验步骤大概是怎样的。

A1：能够设计该种真菌特异性表达产物的引物，通过qpcr来特异性定量检测其dna含量，从而定量检测其生物量。

整个实验的难点可能在于样品的提取，qpcr按照试剂盒说明书做即可

A2：可以通过设计特异性引物并使用qPCR技术来定量检测特定真菌的DNA含量，从而推测其生物量。具体的实验步骤大概如下：

首先需要收集士土样品，将其进行粉碎和筛选，以获得较为均匀的样品。

提取士土样品中的真菌DNA，可以采用商用的DNA提取试剂盒或自制方法。

设计特异性引物，需要通过生物信息学方法从已知真菌的基因序列中筛选出比较保守的区域，并进行引物设计和验证。

进行qPCR反应，将提取到的真菌DNA和特异性引物一起进行PCR扩增，并使用荧光探针或SYBR Green等荧光染料进行检测和定量。

利用标准曲线法或相对定量法计算出样品中真菌的DNA含量，从而推测出其生物量。

整个实验的难点在于引物设计和验证，需要通过多种方法来确保引物的特异性和灵敏度。最耗时的部分可能是样品处理和DNA提取，以及引物的优化和反应条件的确定。

A3：可以通过设计特异性引物和使用qPCR技术来定量检测土壤中单独一种真菌的DNA含量，从而间接地推断其生物量。这种方法被称为qPCR定量法或定量PCR。其基本原理是利用PCR技术扩增目标DNA片段，然后通过荧光探针或染料来定量检X而推算出样品中目标DNA的含量。

整个实验的难点在于1.引物的设计:需要根据目标真菌的特异性序列设计引物，确保引物与其他物种的DNA不发生交叉反应，同时能够高效特异地扩增目标真菌的DNA。2.样品的处理:由于土壤样品中存在大量的其他微生物和有机物，需要进行活当的外理来处化目标真菌的DNA并去除干扰物质3.qPCR反应条件的优化: 需要对PCR反应条件进行优化，包括引物浓度、PCR反应体系、PCR程序等以确保PCR反应的高效性和特异性。4.数据分析:需要对qPCR数据进行分析和解释，包括确定目标真菌的DNA含量，计算其生物量等。

在整个实验中，样品处理和qPCR反应条件的优化可能是最耗时的部分。一般的实验步骤包括

1.提取土壤样品中的DNA，并进行纯化和浓缩。2.设计并合成特异性引物。3.优化qPCR反应条件，包括PCR体系的优化和PCR程序的设置。4.扩增DNA片段并用荧光探针或染料定量检测PCR产物的数量。5.计算目标真菌的DNA含量，并推算其生物量。需要注意的是，实验过程中需要采取一系列的对照实验来验证实验的可靠性和准确性，包括PCR阴性对照、标准曲线建立等。

A4：可以通过设计某种引物通过qpcr来特异性定量检测其dna含量，从而定量检测其生物量。难点在于特异性引物的选取

Q：定点突变之后同源重组完毕，电泳显示有条带，为什么转化后的板子不长菌落

A1：转化的时候有误，可以重新实验。目的基因和载体都切开，特别是目的基因如果是PCR后直接酶切效率会较低；载体上两个酶切位点连在一起，感受态的效率问题，转化过程对不对，如抗生素加的对不对。

A2：考虑是纯化过程没有做好，Dpn1消化后，使用纯化试剂盒后纯化一下，然后用异丙醇再纯化一遍

A3：如果在转化后的板子上未能长出菌落，可能有以下几种原因：

宿主细胞对重组体不敏感：有些宿主细胞对重组体的生长和繁殖不敏感，可能会导致重组体不能在转化板上生长。可以尝试使用不同种类的宿主细胞进行转化，以找到适合重组体生长和繁殖的宿主。

转化过程中重组体受到损伤：在转化过程中，重组体可能会受到电击、化学药剂或其他因素的损伤，导致其不能在转化板上生长。可以尝试优化转化条件，包括电击电压和时间、化学药剂的浓度和处理时间等。

质粒或DNA的质量不好：质粒或DNA的质量不好可能会影响重组体的稳定性和完整性，从而导致不能在转化板上生长。可以尝试使用高质量的质粒或DNA进行转化，或对质粒或DNA进行纯化和检测。

菌落被其他细菌污染：转化板在转化过程中可能会被其他细菌污染，导致重组体不能在转化板上生长。可以尝试使用无菌的转化板和操作环境，并加入适当的抗生素进行筛选和鉴定。